CRISPR (Công nghệ chỉnh sửa gen bằng tia cực tím) là kỹ thuật chỉnh sửa gen thế hệ thứ ba: CRISPR đã cách mạng hóa thế giới.

Hệ thống lặp lại ngắn xen kẽ đều đặn (CRISPR) là kỹ thuật chỉnh sửa bộ gen thế hệ thứ ba đã cách mạng hóa thế giới với kết quả năng suất cao. Nó đã được sử dụng để điều trị nhiều bệnh và nhiễm trùng sinh học khác nhau. Nhiều loại vi khuẩn và sinh vật nhân sơ khác (như vi khuẩn cổ) cũng có hệ thống CRISPR/Cas9 để chống lại thực khuẩn thể. Người ta đã báo cáo rằng các chiến lược dựa trên CRISPR/Cas9 có thể ức chế sự phát triển và tiến triển của ung thư vú ba thể âm tính (TNBC) bằng cách nhắm mục tiêu vào các gen kháng thuốc, phiên mã và điều hòa biểu sinh có khả năng bị thay đổi. Những can thiệp trị liệu này có thể giúp giải quyết các vấn đề khó khăn như kháng thuốc được quan sát thấy ngay cả ở TNBC. Hiện nay, nhiều phương pháp được sử dụng để đưa CRISPR/Cas9 đến các tế bào đích, chẳng hạn như phương pháp vật lý (tiêm vi mô, điện xung và thủy động lực học), phương pháp virus (virus liên kết adeno và lentivirus) và phương pháp không virus (liposome và hạt nano lipid). Mặc dù nhiều mô hình đã được phát triển để nghiên cứu nguyên nhân phân tử của TNBC, nhưng việc thiếu các phương pháp nhạy cảm và nhắm mục tiêu để đưa các công cụ chỉnh sửa bộ gen vào cơ thể sống đã hạn chế ứng dụng lâm sàng của chúng. Tóm lại, bài đánh giá này xem xét toàn diện những tiến bộ, thách thức, hạn chế và triển vọng của phương pháp điều trị CRISPR/Cas9 đối với ung thư vú ba âm tính (TNBC) dựa trên các bằng chứng hiện có. Chúng tôi cũng nhấn mạnh cách kết hợp trí tuệ nhân tạo và máy học có thể cải thiện các chiến lược CRISPR/Cas9 trong điều trị TNBC.
Ung thư được đặc trưng bởi sự phân chia tế bào không kiểm soát, sự phá vỡ các điểm kiểm soát chu kỳ tế bào và đột biến trong các gen ức chế khối u (TSG) (Matthews và cộng sự, 2022). Trong số các loại ung thư khác nhau, ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ và có tỷ lệ tử vong cao trên toàn thế giới (Waks và Winer, 2019). Ung thư vú là một bệnh không đồng nhất với nhiều đặc điểm khác nhau, chẳng hạn như đặc điểm mô học và sinh học, biểu hiện và hành vi lâm sàng, và đáp ứng với điều trị (Weigelt và cộng sự, 2010). Phân loại ung thư vú cung cấp những hiểu biết chính xác cho việc chẩn đoán ung thư vú và tiên lượng khối u. Việc sử dụng các dấu ấn sinh học phổ biến và các đặc điểm lâm sàng bệnh lý là tiêu chí chính để phân loại ung thư vú (Tsang và Tse, 2019). Tiên lượng và đáp ứng với điều trị ung thư vú bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm sự hiện diện của thụ thể estrogen (ER), thụ thể progesterone (PR), thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì người 2 (HER2/neu), và cấp độ mô học, loại khối u và mức độ ác tính. kích thước và di căn hạch bạch huyết (Al-Tubaiti, 2020). Năm phân nhóm phân tử nội tại của ung thư vú đã được xác định, bao gồm luminal A, luminal B, giàu HER2, dạng basal và claudin thấp (Prat et al., 2015). TNBC là một phân nhóm phân tử của ung thư không biểu hiện tất cả ER, PR và HER2 (Yin et al., 2020). Những đặc điểm bệnh lý này liên quan đến TNBC, khẳng định sự tiến triển nhanh chóng và tính chất hung hăng hơn bất kỳ loại ung thư vú nào khác (Feng et al., 2018). Ngoài ra, Peru et al (2000) đã sử dụng công nghệ microarray để phân loại lại ung thư vú và xác định năm phân nhóm nội tại của ung thư vú (Cadenas, 2012). Ung thư vú dạng basal là một phân nhóm của ung thư vú có kiểu hình ba âm tính và liên quan đến sự tiến triển nhanh chóng. Cần lưu ý rằng tất cả các trường hợp ung thư vú dạng basal-like thường bị chẩn đoán nhầm là TNBC, nhưng chỉ có 77% là TNBC; ngược lại, 71–91% TNBC là dạng basal-like, cho thấy hai loại ung thư vú này chồng chéo nhau và thuộc các phân loại khác nhau (Wang D.-Y. et al., 2019). Điều này tạo ra nhu cầu cần thiết phải xác định rõ tính không đồng nhất của TNBC để làm sáng tỏ tiên lượng và xác định các phản ứng tiềm năng đối với các phương pháp điều trị hiện tại và tương lai. Ngoài ra, TNBC chiếm 15–20% tổng số ca ung thư vú và phổ biến hơn ở phụ nữ dưới 50 tuổi. Đột biến BRCA1 hoặc BRCA2 đã được báo cáo ở khoảng 20% ​​​​các trường hợp TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng TNBC có môi trường vi mô miễn dịch đặc thù bao gồm nồng độ cao các yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu, đại thực bào liên quan đến khối u (TAM), tế bào lympho xâm nhập khối u (TIL) và các phân tử khác liên quan đến sự phát triển và di chuyển của khối u. Do đó, hiểu rõ môi trường vi mô của TNBC là rất quan trọng đối với tiên lượng và điều trị bệnh (Fan và He, 2022).
Để đánh giá tiên lượng của TNBC và đảm bảo điều trị hiệu quả, chẩn đoán chính xác, chủ yếu dựa trên phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC) để phát hiện ER, PR và HER2, và chụp nhũ ảnh để phát hiện các khối u vú, là rất quan trọng. Tuy nhiên, chụp nhũ ảnh không thể mô tả đầy đủ các đặc điểm bên trong khối u như hoại tử và xơ hóa (Deepak Singh và cộng sự, 2021). Vì tiên lượng và chẩn đoán kém khiến bác sĩ không thể kê đơn thuốc phù hợp (Chaudhary, 2020), nên nhiều chiến lược khác nhau được sử dụng để cải thiện việc chăm sóc cho bệnh nhân TNBC. Hiện nay, hai loại thuốc, doxorubicin và cyclophosphamide, được sử dụng ở bệnh nhân TNBC và đã cho thấy kết quả tốt. Ngoài ra, các loại thuốc platin khác cũng được sử dụng, chẳng hạn như carboplatin và cisplatin (Sikov và cộng sự, 2015). Thêm vào đó, các chất ức chế PARP như Olaparib, Velaparib và PF-01367338 đã được sử dụng như các loại thuốc hóa trị tiềm năng để điều trị TNBC (Ishino và cộng sự, 2018). Vì các con đường tín hiệu Wnt/β-Catenin, NOTCH và Hedgehog được báo cáo là có liên quan đến sự xuất hiện và tiến triển của TNBC, nên việc nhắm mục tiêu thuốc vào các con đường này có thể là một chiến lược quan trọng (Aysola et al., 2013). Mặc dù phẫu thuật, xạ trị và hóa trị vẫn là phương pháp điều trị chính cho TNBC hiện nay, nhưng đã có những tiến bộ đáng kể trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới bao gồm liệu pháp nhắm mục tiêu, liệu pháp miễn dịch, các công cụ chỉnh sửa gen liên quan đến CRISPR khác nhau như Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, chỉnh sửa prime và liệu pháp gen nhắm mục tiêu CRISPR/Cas9. Ở đây, chúng ta sẽ tập trung vào các công cụ chỉnh sửa gen liên quan đến CRISPR khác nhau được sử dụng trong điều trị TNBC. Trong số đó, CRISPR/Cas9 đã nhận được sự chú ý rộng rãi.
Cas9n, còn được gọi là Cas9 nickase, là một biến thể được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền của protein Cas9, có nguồn gốc từ hệ thống chỉnh sửa bộ gen CRISPR/Cas9 (Gupta và cộng sự, 2019). Ở dạng ban đầu, protein Cas9 chứa hai miền nuclease: RuvC và HNH, chức năng chính của chúng là cắt cả hai sợi DNA. Tuy nhiên, trong Cas9n, một trong các miền nuclease, HNH, bị đột biến gen và trở nên không hoạt động. Do đó, miền HNH của Cas9n vẫn không hoạt động. Chỉ có miền RuvC vẫn hoạt động, cho phép Cas9n cắt hoặc tạo ra các vết đứt trên các sợi DNA đơn (Trevino và Zhang, 2014). So với Cas9, Cas9n có thể giảm thiểu hiệu quả các tác dụng ngoài mục tiêu và cải thiện chính xác cơ chế sửa chữa tế bào. Cas9n có thể được sử dụng để giải quyết nhiều vấn đề khác nhau, chẳng hạn như tạo ra các vết đứt tại các vị trí cụ thể trong DNA mạch đôi. Vì mục đích này, hai phân tử Cas9n đã được kết hợp và sử dụng cùng nhau (Yee, 2016). Kinase dòng hỗn hợp 3 (MLK3) là một loại protein kinase được hoạt hóa bởi chất kích thích phân bào, đóng vai trò là chất điều hòa chính trong quá trình di căn của TNBC (Cronan và cộng sự, 2012).
MLK3 có thể kích hoạt nhiều con đường tín hiệu dẫn đến di căn ung thư vú ba âm tính (TNBC). Ví dụ, con đường kinase c-Jun N-terminal (JNK) điều chỉnh khả năng vận động của tế bào và sự thoái hóa chất nền ngoại bào, và MLK3 kích hoạt con đường JNK, do đó tăng cường khả năng vận động của tế bào và tạo ra các đặc tính xâm lấn (Rattanasinchai và Gallo, 2016). MLK3 cũng điều chỉnh quá trình chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT). Để làm được điều này, nó kích hoạt các yếu tố phiên mã hạ nguồn như Snail, Slug và Twist. Các yếu tố này ức chế sự biểu hiện của các dấu ấn biểu mô và thúc đẩy sự biểu hiện của các dấu ấn trung mô, dẫn đến việc hình thành kiểu hình di căn (Casalino và cộng sự, 2023). MLK3 được quan sát thấy đóng vai trò trong việc tái cấu trúc chất nền ngoại bào (ECM) và kích hoạt các protease như metalloproteinase ma trận (MMP) làm thoái hóa ECM. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm lấn và lan rộng của tế bào khối u đến các vị trí xa (Katari và cộng sự, 2019). Do đó, các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng MLK3 đóng vai trò quan trọng trong TNBC. Rattanasinchai và Gallo đã sử dụng mô hình TNBC để nghiên cứu vai trò của MLK3 và phát hiện ra rằng nó thúc đẩy sự phát triển ung thư thông qua các con đường tín hiệu cụ thể. Họ đã sử dụng CRISPR/Cas9n để chỉnh sửa MLK3 và quan sát thấy sự giảm đáng kể trong di căn TNBC (Rattanasinchai và Gallo, 2016).
dCas9, thường được gọi là Cas9 bất hoạt, là một dạng dẫn xuất được sửa đổi của protein Cas9. Không giống như Cas9 hoạt động, dCas9 thiếu hoạt tính endonuclease, khiến nó không thể gây ra sự đứt gãy chuỗi kép DNA. Do đó, dCas9 có thể được sử dụng để nhắm mục tiêu chính xác vào các vùng cụ thể của bộ gen mà không làm thay đổi hoặc sửa đổi trình tự DNA (Wang et al., 2016). Trong dCas9, hai protein endonuclease, RuvC và HNH, bị bất hoạt bằng cách ức chế các dư lượng axit amin quan trọng (Richter et al., 2016). Mặc dù thiếu hoạt tính cắt DNA, dCas9 đóng một số vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền và công nghệ sinh học. Ví dụ, nó cho phép hình dung các vùng cụ thể của bộ gen, tạo điều kiện thuận lợi cho điều hòa phiên mã và thúc đẩy các sửa đổi biểu sinh (Brocken et al., 2018).
Yếu tố phiên mã ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) đóng vai trò đặc biệt và quan trọng trong việc điều hòa quá trình chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT), một quá trình tế bào xảy ra trong quá trình phát triển phôi thai, sửa chữa mô và tiến triển ung thư. Quá trình này liên quan đến sự biến đổi của các tế bào biểu mô thành tế bào trung mô, dẫn đến những thay đổi về hình thái tế bào, khả năng vận động, khả năng xâm lấn, v.v. (Wu et al., 2020). ZEB1 ức chế nhiều dấu ấn biểu mô, chẳng hạn như E-cadherin và Occludin, chịu trách nhiệm duy trì sự kết dính giữa các tế bào và tính phân cực của các tế bào biểu mô trong TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Ngoài ra, ZEB1 kích hoạt một số dấu ấn nhất định như N-cadherin, vimentin và fibronectin (Konradi et al., 2014) và cũng điều chỉnh các gen liên quan đến quá trình tái cấu trúc khung xương tế bào như Rho GTPase và metalloproteinase ma trận (MMP) (Huang). (et al., 2014). 2022), ngoài ra, nó còn ảnh hưởng đến nhiều con đường truyền tín hiệu khác nhau như yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β (TGF-β), tín hiệu Wnt, v.v., do đó thúc đẩy sự xâm lấn và di căn khối u trong TNBC (Chen et al., 2016). ). Nhiều nghiên cứu và bằng chứng khoa học chỉ ra rằng ZEB1 có tiềm năng lớn như một tác nhân có giá trị trong việc phát hiện và can thiệp điều trị TNBC. Trong một nghiên cứu gần đây, Waryah et al. đã sử dụng mô hình TNBC và đạt được sự ức chế hoàn toàn ZEB1 bằng dCas9. Do đó, họ đã quan sát thấy tính đặc hiệu rất cao và sự ức chế gần như hoàn toàn ZEB1 trong điều kiện in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 là một công cụ chỉnh sửa gen có tên gọi CRISPR/Cpf1. Nó được phát triển từ hệ thống CRISPR/Cas, trong đó thuật ngữ Cas12 đề cập đến protein liên kết CRISPR 12 (Bharathkumar et al., 2022), hoàn toàn tương tự như Cas9. Sự khác biệt duy nhất là nó chứa protein Cas12. So với Cas9, Cas12 có một số chức năng độc đáo như tạo ra các đầu dính trong quá trình chỉnh sửa gen, trong khi Cas9 tạo ra các đầu cùn (Wang et al., 2021). Đặc tính này của Cas12 góp phần vào công nghệ thao tác DNA đặc thù của nó. Là một protein có khả năng nhận biết và cắt chính xác DNA mục tiêu, nó có tính linh hoạt vượt trội, khiến nó trở thành một công cụ hiệu quả cho nhiều ứng dụng, bao gồm cả chỉnh sửa gen (Pickar-Oliver và Gersbach, 2019).
Tương tự như các biến thể CRISPR khác, CRISPR/Cas12 cũng có khả năng loại bỏ hoặc kích hoạt gen trong TNBC, nhắm mục tiêu vào các gen đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh hoặc phản ứng với điều trị (Yang và Zhang, 2023). Để thực hiện quá trình này, một RNA dẫn hướng (gRNA) đã được phát triển để hướng Cas12 đến gen mục tiêu. Khi Cas12 liên kết với mục tiêu, nó sẽ tạo ra các vết đứt đôi trong DNA và kích hoạt các cơ chế sửa chữa DNA. Trong quá trình sửa chữa, các nucleotide không chính xác có thể được kết hợp, dẫn đến đột biến gen và mất chức năng (Zhang và cộng sự, 2021a). Ngoài ra, một phiên bản cải tiến của enzyme Cas12 (gọi là dCas12) cũng được sử dụng để kích hoạt gen. Bằng cách kết hợp nó với một chất kích hoạt phiên mã, có thể cảm ứng một số gen nhất định, từ đó kích hoạt chúng. Công nghệ này có tiềm năng lớn trong việc thúc đẩy sự hoạt hóa các gen ức chế khối u (Sultan và cộng sự, 2022).
Chỉnh sửa mồi (Prime editing) là một công nghệ chỉnh sửa bộ gen mới được phát triển và vô cùng ưu việt. Nó có khả năng sửa đổi DNA của một sinh vật một cách rất chính xác (Chen và Liu, 2023). Chỉnh sửa mồi được thực hiện thông qua sự kết hợp của hai thành phần chính: enzyme CRISPR/Cas9 đã được sửa đổi và enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase). Vai trò của enzyme CRISPR/Cas9 là nhắm mục tiêu chọn lọc vào các vị trí chính xác trong bộ gen, trong khi enzyme sao chép ngược giúp sửa đổi triệt để DNA tại vị trí mục tiêu (Hassan và cộng sự, 2021). Trong cơ chế chỉnh sửa mồi, bước đầu tiên liên quan đến việc tạo ra RNA dẫn hướng chỉnh sửa mồi (pegRNA) (Standage-Beier và cộng sự, 2021). Nó chứa trình tự mục tiêu và khuôn RNA tương ứng với vị trí chỉnh sửa mong muốn trong DNA mục tiêu. Sau đó, pegRNA được đưa vào tế bào mục tiêu cùng với nuclease chỉnh sửa mồi (PE2). PE2 là một protein lai bao gồm enzyme Cas9, enzyme sao chép ngược và bộ chuyển đổi chỉnh sửa mồi (Martín-Alonso và cộng sự, 2021). Bên trong tế bào, phức hợp pegRNA và PE2 tìm kiếm đoạn DNA cụ thể mà chúng muốn sửa đổi. Enzyme Cas9 cắt DNA và tạo ra một khuôn mẫu gồm các chuỗi đơn (Choi và cộng sự, 2022). Enzyme sao chép ngược sử dụng khuôn mẫu này để chuẩn bị DNA cho quá trình chỉnh sửa. Cùng với việc sao chép DNA, các hướng dẫn để chỉnh sửa khuôn mẫu RNA cũng được bao gồm. Cuối cùng, chuỗi DNA mới được tạo ra được sử dụng làm khuôn mẫu để sửa chữa chỗ đứt trong DNA, dẫn đến một trình tự DNA bị thay đổi chứa sự sửa đổi mong muốn (Ochoa-Sanchez và cộng sự, 2021). Cơ chế chỉnh sửa bằng mồi có thể dẫn đến đột biến lan rộng trong gen. Nó có thể nhắm mục tiêu vào các đột biến điểm, chèn, xóa và thậm chí cả thay thế gen (Anzalone và cộng sự, 2019; Chen và Liu, 2023). Chỉnh sửa bằng mồi mang lại một số lợi thế so với các công nghệ chỉnh sửa bộ gen trước đây. Chúng bao gồm độ chính xác cao hơn, giảm tác dụng ngoài mục tiêu và khả năng chỉnh sửa DNA mà không cần dựa vào sự đứt gãy chuỗi kép DNA (Anzalone và cộng sự, 2020).
Công nghệ CRISPR/Cas9 ban đầu được phát triển để bảo vệ vi khuẩn khỏi sự chuyển giao plasmid và nhiễm trùng phage, sau đó được tái sử dụng như một công cụ nhắm mục tiêu DNA dựa trên RNA hiệu quả để chỉnh sửa bộ gen (Jiang và Doudna, 2017). Ngoài ra, hệ thống CRISPR/Cas9 được báo cáo là có mặt trong 50% và 87% bộ gen của vi khuẩn và vi khuẩn cổ, tương ứng (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 là một công cụ tiềm năng để xóa, chèn và sửa chữa bất kỳ trình tự gen bất thường nào bằng cách sử dụng các phương thức in vivo và in vitro (Sabit et al., 2021). Hơn nữa, CRISPR/Cas9 đã được chứng minh là một phần của hệ thống miễn dịch thích ứng do tính đặc hiệu của nó đối với các gen mục tiêu cần quan tâm (Chen và Zhang, 2018).
Hệ thống CRISPR/Cas9 bao gồm Cas9 và một RNA dẫn hướng đơn (sgRNA). Cas9 là một endonuclease được cấu tạo từ nhiều thành phần protein. Ngoài ra, Cas9 có các đặc tính cấu trúc và hình thái độc đáo (Pacesa et al., 2022) vì nó bao gồm hai thùy: nhận dạng (REC) và nuclease (NUC). Thùy REC được chia nhỏ hơn nữa thành ba vùng: REC1, REC2 và các xoắn cầu nối (Cromwell et al., 2018). NUC bao gồm ba thùy, cụ thể là RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH và miền tương tác motif liền kề protospacer (PAM) (Hình 1) (Song et al., 2016). sgRNA bao gồm hai thành phần, bao gồm RNA CRISPR (crRNA) và RNA nhỏ chuyển mã (RNA đánh dấu) (Hình 1). sgRNA kết nối protein Cas9 với connexin để tạo thành một phức hợp hoạt động, còn được gọi là phức hợp tác động (Richter et al., 2012). crRNA là một cặp bazơ nucleotide gồm 18-20 nucleotide đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện trình tự DNA đích. Ngoài ra, crRNA bắt cặp với DNA đích, và tracrRNA hoạt động như một khung đỡ cho nuclease Cas9 liên kết với DNA đích (Manghwar et al., 2019). Mặt khác, trình tự PAM có 3 nucleotide, xác nhận, chỉ định và trung gian cho sự liên kết của phức hợp tác động với DNA. Các tiểu đơn vị RuvC và HNH của phức hợp protein Cas9 có hoạt tính xúc tác (Richter et al., 2012; Asmamaw và Zawdie, 2021). Miền nuclease HNH của tiểu đơn vị Cas9 cắt chuỗi DNA liên kết với crRNA. Vùng nuclease RuvC cắt các sợi DNA khác và tạo ra các vết đứt đôi (DSB), sau đó hai cơ chế sửa chữa vết đứt DNA khác nhau được kích hoạt (Jiang và Doudna, 2017) (Hình 1).
Hình 1. Tổng quan về CRISPR/Cas9 (A). Các thành phần của hệ thống CRISPR/Cas9: (i). Enzyme endonuclease Cas9 chịu trách nhiệm cắt chuỗi DNA mục tiêu, (ii) một RNA dẫn hướng đơn (sgRNA) được tạo ra từ sự kết hợp của crRNA và tra-crRNA. (hai). Cas9 bao gồm một số thành phần như Rec I, Rec II, thùy NUC (HNH và Ruv C là các thành phần phụ) và miền tương tác PAM (C) với các chức năng tương ứng. Phức hợp protein CRISPR/Cas9 cắt các chuỗi DNA thành dạng không bổ sung và bổ sung (D). CRISPR/Cas9 chỉnh sửa bộ gen qua ba giai đoạn: nhận dạng, cắt và sửa chữa. sg-RNA được thiết kế sẽ hướng dẫn Cas9 và nhận dạng chuỗi mong muốn thông qua thành phần bổ sung crRNA. Cas9 nhận dạng chuỗi PAM tại 5′-NGG-3′ và làm tan chảy DNA, tạo thành một lai DNA-RNA và kích hoạt quá trình cắt. Vùng HNH của Cas9 cắt chuỗi bổ sung, còn vùng RuvC cắt chuỗi không bổ sung. Hệ thống CRISPR/Cas9 sửa chữa DNA sợi đôi bằng cách phá vỡ nó theo hai cách: nối đầu không tương đồng (NHEJ) và sửa chữa định hướng tương đồng (HDR). NHEJ sửa chữa DNA sợi đôi khi không có DNA tương đồng ngoại lai thông qua một quá trình enzym, một cơ chế dễ xảy ra lỗi có thể chèn hoặc loại bỏ các trình tự DNA ngẫu nhiên. HDR rất đặc hiệu và yêu cầu các khuôn mẫu DNA tương đồng.
Các con đường sửa chữa trung gian bởi CRISPR/Cas9 bao gồm cơ chế nối đầu không tương đồng (NHEJ) và sửa chữa định hướng tương đồng (HDR). NHEJ là một con đường dễ xảy ra lỗi vì nó liên quan đến việc chèn hoặc xóa và không yêu cầu bất kỳ khuôn mẫu nào trong quá trình sửa chữa. Nó sử dụng các nucleotide ngẫu nhiên để tạo ra các protein tiêu chuẩn (Abbasi et al., 2021). Hệ thống sửa chữa này bao gồm bốn phức hợp như phức hợp KU, phức hợp protein bổ sung chéo loại 4 (XRCC-4), enzyme xử lý đầu DNA và protein kinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Protein phức hợp KU có hai tiểu đơn vị, Ku 70 và Ku 80, và đóng vai trò quan trọng trong cơ chế NHEJ, vì cơ chế sửa chữa được khởi đầu bằng sự liên kết của hai tiểu đơn vị (Ku 70 và Ku 80) với các đầu cùn hoặc gần cùn của DNA đích (Abbasi et al., 2021), đóng vai trò như một khung để thu hút các yếu tố liên quan đến NHEJ khác đến vị trí tổn thương (Yang et al., 2020). XRCC-4 và DNA ligase lần lượt bao gồm 334 và 911 axit amin, và phức hợp XRCC4-DNA ligase IV kích thích sự nối các đầu DNA (Chatterjee et al., 2015). Enzyme xử lý đầu DNA, còn được gọi là polynucleotide kinase 3′-phosphate, là một enzyme xử lý đầu DNA. Nó có thể loại bỏ nhóm 3′P trong DNA và phosphoryl hóa nhóm 5′OH trong quá trình sửa chữa DSB. Quá trình này cũng bao gồm việc sửa chữa các đứt gãy chuỗi đơn (SSB) bằng cách sử dụng con đường sửa chữa SSB (Chatterjee et al., 2015). Protein kinase DNA-PKcs là một protein kinase phụ thuộc DNA bao gồm một tiểu đơn vị xúc tác của họ PIKK (phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase) và ataxia telangiectasia mutated (ATM), cũng như ATM và Rad3-related ATRs. Nó sửa chữa các đứt gãy chuỗi kép (DSB) và đứt gãy chuỗi đơn (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR là cơ chế sửa chữa chính xác và phù hợp hơn vì thông tin được sao chép bằng cách sử dụng dạng nguyên vẹn của chuỗi DNA kép tương đồng, mặc dù nó đòi hỏi sự hiện diện của các nhiễm sắc thể chị em. Điều này xảy ra trong pha S/G2 của chu kỳ tế bào động vật có vú. HDR chủ yếu xảy ra ở các loài nấm men, nhưng NHEJ rất quan trọng ở động vật có vú (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Cơ chế sửa chữa hoàn chỉnh được thể hiện trong Hình 1.
Vì TNBC do các bất thường về di truyền và biểu sinh gây ra, việc điều chỉnh các bất thường về gen/biểu sinh ác tính bằng CRISPR/Cas9 có thể là một phương pháp điều trị hợp lý (Chen et al., 2019). Ngoài ra, một số yếu tố phiên mã tham gia vào quá trình điều hòa phiên mã đặc hiệu tế bào có thể thể hiện các đặc điểm độc đáo của tế bào ung thư, cho thấy rằng điều hòa phiên mã có thể là một phương pháp tuyệt vời để điều trị ung thư (Drost et al., 2017). Khai thác các đặc điểm phân tử này của khối u, chẳng hạn như các khiếm khuyết về di truyền, biểu sinh và phiên mã, để phát triển thuốc có thể cải thiện kết quả lâm sàng và giảm chi phí sàng lọc. CRISPR là một công cụ chỉnh sửa gen tiềm năng không chỉ có thể phát hiện và xác định các mục tiêu gen gây ung thư mà còn có thể được sử dụng để chỉnh sửa, ức chế và sửa đổi biểu sinh các gen gây ung thư trong tế bào người (Bảng 1) (Ahmed et al., 2021). Một số sàng lọc CRISPR đã được tiến hành để tìm kiếm các gen liên quan đến gen ức chế khối u, gen gây ung thư và kháng thuốc. Hình 2 minh họa việc sử dụng CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa các gen gây ung thư TNBC khác nhau.
Hình 2. Chỉnh sửa gen của nhiều gen sinh ung thư TNBC khác nhau bằng CRISPR/Cas9 dẫn đến giảm sự phát triển và di căn của khối u. Các gen sinh ung thư này bao gồm CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 và CXCR7, Crypto1, ROR1 và ST8SIA, có liên quan đến sự hình thành và di căn của TNBC.
Sự di chuyển, xâm lấn của tế bào ung thư và quá trình chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT) có liên quan đến ITGA9. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng ITGA9 là một yếu tố quan trọng trong con đường tín hiệu Notch và đóng vai trò thú vị trong sự di căn của u cơ vân (Molist et al., 2020). Ngoài ra, ITGA9 được phát hiện có liên quan chặt chẽ đến tiên lượng bệnh nhân ở một số loại khối u, bao gồm cả ung thư vú (Wang Z. et al., 2019). Hơn nữa, phân tích tin sinh học của ITGA9 cho thấy biểu hiện của nó trong TNBC cao hơn đáng kể so với các phân nhóm ung thư vú khác. Nồng độ ITGA9 tăng cao có liên quan đến sự di căn và tái phát khối u ở bệnh nhân TNBC. Việc loại bỏ ITGA9 bằng CRISPR/Cas9 dẫn đến các đặc tính giống tế bào gốc ung thư (CSC), sự hình thành mạch máu khối u, sự phát triển khối u và giảm di căn bằng cách thúc đẩy sự thoái hóa β-catenin trong TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 là một thành viên của họ TGF-β và rất quan trọng đối với quá trình phôi thai sớm, duy trì tế bào gốc và di căn ung thư (Ishii et al., 2021). Còn được gọi là Tdgf-1, nó là một protein tín hiệu neo GPI gây ung thư tham gia vào việc điều hòa sự hình thành của vệt nguyên thủy, trung bì và nội bì, cũng như thiết lập sự bất đối xứng trái/phải trong sự phát triển của các cơ quan trong cơ thể trong quá trình phôi thai (Zhang et al., 2021b). Ngoài ra, Cripto-1 đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT) như một dấu ấn của tế bào gốc (Zhang et al., 2021b). EMT rất quan trọng không chỉ đối với các quá trình khác nhau như phát triển phôi thai, xơ hóa và chữa lành vết thương, mà còn đối với sự xâm lấn và di căn của ung thư. Thêm vào đó, Cripto-1 đã được chứng minh là tương tác với bốn thụ thể Notch và tăng cường quá trình trưởng thành sau dịch mã của chúng (Brandstadter và Maillard, 2019). Con đường tín hiệu Notch được biết là có liên quan đến việc duy trì các tế bào ung thư vú ở người. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc loại bỏ gen Crypto-1 bằng phương pháp CRISPR/Cas9 ức chế sự phát triển và di căn của ung thư. Do đó, Crypto-1 có thể trở thành một mục tiêu điều trị quan trọng đối với TNBC (Castro và cộng sự, 2015).
Protein XCL12 và thụ thể chemokine CXC (CXCR4 và CXCR7) đóng nhiều vai trò khác nhau trong sự tăng sinh, phát triển, di chuyển và xâm lấn của tế bào ung thư (Wu et al., 2015). Các thụ thể hóa học này có liên quan đến sự phát triển của TNBC thông qua nhiều con đường tín hiệu trong cả mô hình in vivo và in vitro (Wu et al., 2015). Ngoài ra, sự hoạt hóa của CXCR4 và CXCR7 có liên quan đến khả năng di căn cao hơn và tiên lượng xấu hơn ở TNBC (Karn et al., 2022). Do đó, việc loại bỏ CXCR4 và CXCR7 có thể trở thành các gen mục tiêu hiệu quả để điều trị ung thư vú, bao gồm cả TNBC. Nghiên cứu của Yang et al. (2019) đã sử dụng CRISPR/Cas9 để loại bỏ đồng thời gen CXCR4 và CXCR7 và nhận thấy rằng sự tăng sinh, phát triển, di chuyển và xâm lấn của TNBC đã bị ức chế đáng kể (Yang et al., 2019).
Mức độ miR-3662, một gen sinh ung thư TNBC, tăng cao đã được quan sát thấy trong mô ung thư vú (Yi và cộng sự, 2022). Việc ức chế miR-3662 đã được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển và di căn khối u ung thư vú cả trong ống nghiệm và trên cơ thể sống (Agarwal và Gupta, 2021). HBP-1 là một chất ức chế mạnh mẽ của tín hiệu Wnt/β-catenin và có khả năng chịu trách nhiệm cho sự phát triển tế bào TNBC do miR-3662 điều hòa. Gần đây, Yi và cộng sự đã phát hiện ra rằng trục miR-3662-HBP1 điều hòa con đường tín hiệu Wnt/β-catenin trong tế bào TNBC (Yi và cộng sự, 2022). Do biểu hiện đặc hiệu ở khối u, miR-3662 có thể là một mục tiêu điều trị tiềm năng cho TNBC. Do đó, việc ức chế miR-3662 bằng CRISPR/Cas9 có thể là một phương pháp tuyệt vời để phát triển các loại thuốc mới điều trị TNBC.
UBR5 là một nucleophosphoprotein 300 kDa được xác định là yếu tố điều hòa quan trọng của quá trình hình thành khối u, di căn và phản ứng miễn dịch trong nhiều loại ung thư (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 được báo cáo là tăng cao trong các mẫu TNBC và kích thích chức năng ERα bằng cách gây ra sự tăng sinh thông qua hoạt động ubiquitin ligase của nó (Bolt et al., 2015). Các nghiên cứu giải trình tự toàn bộ exome của các mẫu TNBC nguyên phát cũng cho thấy sự gia tăng biểu hiện của UBR5, cho thấy vai trò của nó trong sự phát triển của TNBC. Ngoài ra, việc xóa gen UBR5 bằng CRISPR/Cas9 cho thấy sự ức chế đáng kể quá trình di căn và tăng trưởng của TNBC trong các mô hình chuột thí nghiệm. Hơn nữa, việc bổ sung UBR5 vào mô hình chuột hoang dã đã khôi phục lại chức năng đầy đủ của nó, trong khi hiệu ứng này không được quan sát thấy ở các chủng đột biến bất hoạt (Liao et al., 2017). Thiếu UBR5 có liên quan đến sự gia tăng apoptosis, hoại tử và ức chế sự phát triển khối u trong TNBC do quá trình tạo mạch máu kém. Do mất UBR5, sự lan rộng của khối u đến các cơ quan xa bị giảm, và UBR5 gây ra quá trình chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT) bất thường chủ yếu bằng cách giảm biểu hiện E-cadherin (Zhang và Weinberg, 2018). Gần đây, UBR5 được chứng minh là một yếu tố rất quan trọng trong quá trình phiên mã PDL1 do IFN-γ gây ra ở TNBC do thiếu hoạt động ubiquitin hóa E3. Phân tích transcriptome RNA cho thấy UBR5 có thể có tác động toàn thân lên các gen liên quan đến con đường IFN-γ và thúc đẩy quá trình hoạt hóa phiên mã PDL1 bằng cách tăng mức độ hoạt hóa của protein kinase RNA (PKR) và các chất truyền tín hiệu và chất hoạt hóa của nó, cụ thể là yếu tố phiên mã 1 (STAT1) và yếu tố điều hòa interferon 1 (IRF1). Tuy nhiên, việc loại bỏ đồng thời biểu hiện UBR5 và PD-L1 thông qua CRISPR/Cas9 có tác dụng điều trị hiệp đồng hơn so với việc chỉ phong tỏa một trong hai yếu tố, với những ảnh hưởng sâu sắc đến môi trường vi mô khối u (Wu et al., 2022). Do đó, CRISPR/Cas9 có thể là một công cụ quan trọng để ức chế chức năng của UBR5, từ đó ngăn chặn sự di căn và sự phát triển khối u TNBC.
ROR1 là một loại protein xuyên màng loại I được biểu hiện trong quá trình phát triển ung thư và phôi thai, và đã được xác định là một protein gây ung thư bào thai (Nicholas Borcherding, 2014). Hành vi xâm lấn của nhiều loại ung thư ở người có liên quan đến sự tăng biểu hiện của ROR1. Các kết quả đầy hứa hẹn đã được thu được từ các nghiên cứu in vivo và in vitro liên quan đến các hợp chất điều trị nhắm mục tiêu vào ROR1 (Chien et al., 2016). Mức độ mRNA ROR1 tăng cao trong các mẫu sinh thiết mô vú cũng có liên quan đến các khối u vú dạng đáy (BL) xâm lấn và sự di căn của chúng đến các bộ phận khác của cơ thể. Hơn nữa, sự biểu hiện quá mức của ROR1 đã được xác định là một dấu ấn tiên lượng cho sự phát triển của TNBC (Chien et al., 2016). Tuy nhiên, việc làm im lặng ROR1 bằng CRISPR/Cas9 để ngăn chặn sự phát triển và di căn của TNBC sẽ là một chiến lược hiệu quả.
Quá trình sialyl hóa liên quan đến việc bổ sung axit sialic vào các glycoconjugate, được xúc tác bởi các sialyltransferase (ST). ST8SIA1 thuộc họ ST và đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh khác nhau như bệnh bạch cầu lympho và ung thư đại trực tràng (Chang et al., 2018). Phân tích trình tự RNA cho thấy ST8SIA1 được biểu hiện cao trong mô vú của bệnh nhân TNBC và có tương quan dương tính với các đột biến trong gen ức chế khối u p53, điều này có thể góp phần vào cơ chế bệnh sinh của TNBC (Battula et al., 2017). Ngoài ra, ST8SIA1 có liên quan đến sự di căn và tái phát của TNBC, cho thấy nó đóng vai trò quan trọng trong sự xuất hiện và phát triển của TNBC. Trong mô hình TNBC in vitro, việc ức chế ST8SIA1 bằng CRISPR/Cas9 đã được chứng minh là ngăn chặn sự phát triển và di căn (Battula et al., 2017). Điều này cho thấy CRISPR/Cas9 có thể là một công cụ quan trọng để ức chế chức năng của gen sinh ung thư ST8SIA1 trong điều trị ung thư vú ba âm tính (TNBC).
NAT1 là một enzyme chuyển hóa xúc tác sự hình thành các hợp chất ngoại lai giai đoạn II và được biểu hiện ở hầu hết các mô của con người. NAT1 có thể sử dụng đồng yếu tố folate để nhắm mục tiêu acetyl-CoA ngay cả khi không có chất nền amin thơm (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng NAT1 điều chỉnh chức năng của metalloproteinase ma trận 9 (MMP9) trong các mô hình tế bào ung thư vú và bảo vệ chống lại các gốc oxy phản ứng (ROS) trong điều kiện thiếu glucose (Wang et al., 2018). Việc loại bỏ NAT1 đã được chứng minh là ức chế phức hợp pyruvate dehydrogenase, dẫn đến rối loạn chức năng ty thể (Wang L. et al., 2019). Ngoài ra, nhiều báo cáo khác đã chỉ ra rằng việc ức chế NAT1 bằng các phân tử nhỏ và siRNA có thể làm giảm khả năng xâm lấn và tăng sinh của tế bào ung thư vú (Stepp et al., 2018). Gần đây, công nghệ CRISPR/Cas9 đã được sử dụng để ức chế NAT1 trong dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào tùy thuộc vào mức độ biểu hiện của nó. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng NAT-1 rất quan trọng đối với sự tiến triển và di căn của TNBC (Carlisle và cộng sự, 2020).
Sự phiên mã phối hợp của các gen gây ung thư được điều hòa bởi các siêu chất tăng cường, các yếu tố phiên mã và các đồng yếu tố (Hnisz et al., 2015). Ngoài ra, một nhóm các kinase phụ thuộc cyclin (CDK), chẳng hạn như CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 và CDK13, là cần thiết cho sự điều hòa phiên mã. Trong số đó, CDK7 tham gia vào quá trình phosphoryl hóa RNA polymerase II, điều rất quan trọng đối với sự khởi đầu và mở rộng quá trình phiên mã gen gây ung thư trong bệnh sinh của TNBC. Trong một nghiên cứu quan trọng, việc xóa bỏ CDK7 bằng CRISPR/Cas9 đã ức chế TNBC, cho thấy rằng bệnh sinh của TNBC phụ thuộc vào CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến ở MYC và RBP (protein liên kết RNA) có thể dẫn đến apoptosis, trong khi đột biến gen đơn lẻ ở MYC hoặc RBP không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào ung thư (Einstein và cộng sự, 2021). Hơn 1000 RBP trong bộ gen người đã được sàng lọc bằng thư viện dựa trên CRISPR/Cas9. Trong số đó, 57 RBP được phát hiện là rất quan trọng đối với sự phát triển của tế bào ung thư với mức MYC tăng cao (Wheeler và cộng sự, 2020). Ngoài ra, YTHDF2 rất quan trọng để duy trì sự phát triển của tế bào TNBC và làm giảm lượng bản sao được methyl hóa trong quá trình phiên mã và dịch mã ở mức độ cao trong các tế bào ung thư có biểu hiện MYC cao hơn. Hơn nữa, YTHDF2 không thiết yếu đối với các tế bào ung thư ít phụ thuộc vào mức MYC tăng cao để kéo dài sự sống của bệnh nhân TNBC (Einstein và cộng sự, 2021), cho thấy nó có thể là mục tiêu điều trị tiềm năng cho các loại thuốc có thể khắc phục TNBC.
Các protein ngón tay kẽm (ZNF) chiếm khoảng 1% tổng số bộ gen người. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ZNF có thể điều chỉnh sự tăng sinh tế bào trong nhiều loại ung thư khác nhau, chẳng hạn như ung thư gan, ung thư vú và ung thư đại trực tràng (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Các thư viện được tạo ra bằng phương pháp loại bỏ gen CRISPR đã được sử dụng để sàng lọc các gen ức chế khối u (TSG) khác nhau trong tế bào ung thư vú (Shalem et al., 2014). Kể từ đó, một nghiên cứu về biểu hiện gen của các tế bào ung thư vú bị xóa gen ZNF319 bằng CRISPR/Cas9 đã chỉ ra rằng ZNF319 là một gen ức chế khối u làm giảm sự tăng sinh của ung thư vú và do đó tham gia vào nhiều cơ chế truyền tín hiệu tiềm năng và các chức năng sinh học khác (Wang L. et al., 2022).
Ferroptosis là một loại chết tế bào theo chương trình phụ thuộc vào sự hiện diện của sắt. Người ta biết rằng sự phát triển của ferroptosis bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của các peroxid lipid. Ngoài ra, PKCβII được báo cáo là có biểu hiện peroxy hóa lipid sớm, và sự gia tăng peroxy hóa lipid có liên quan đến ferroptosis. Việc sàng lọc thư viện các chất ức chế kinase được tạo ra bằng CRISPR/Cas9 đã tiết lộ rằng PKCβII tham gia vào quá trình peroxy hóa lipid, điều này rất quan trọng đối với ferroptosis trong tế bào MDA-MB-231 (Zhang và cộng sự, 2022). Do đó, điều này cho thấy rằng việc loại bỏ PKCβII bằng CRISPR/Cas9 có thể là một mục tiêu gen ức chế khối u tiềm năng để điều trị các bệnh liên quan đến ferroptosis (Zhang và cộng sự, 2022).
Tình trạng kháng thuốc được cho là nguyên nhân gây ra khoảng 90% số ca tử vong ở bệnh nhân ung thư và là một trong những thách thức lớn trong điều trị ung thư (Bukowski và cộng sự, 2020). Kết quả cho thấy một số lượng đáng kể các gen liên quan đến sự đào thải thuốc, sửa chữa DNA, quá trình apoptosis và các con đường truyền tín hiệu tế bào khác nhau có liên quan đến tình trạng kháng thuốc (Haider và cộng sự, 2020). Trong số đó, một số gen đã được nhắm mục tiêu bằng công cụ CRISPR/Cas9 và đã cho thấy kết quả đầy hứa hẹn trong việc giảm kháng thuốc và tăng hiệu quả điều trị ung thư (Vaghari-Tabari và cộng sự, 2022). Ngoài ra, các thư viện sàng lọc gen loại bỏ CRISPR/Cas9 có năng suất cao đã được chứng minh là có vai trò trong việc điều chỉnh chức năng của các gen mục tiêu kháng thuốc tiềm năng (Shalem và cộng sự, 2015). Để xác định các gen kháng paclitaxel, phương pháp giải trình tự RNA kết hợp với sàng lọc thư viện sgRNA toàn bộ hệ gen đã được sử dụng để xác định tám gen ứng cử viên, bao gồm histone deacetylase 9 (HDAC9), có liên quan đến kháng thuốc ở bệnh nhân TNBC tái phát (B et al., 2020). Trong một nghiên cứu khác, sự biểu hiện tăng lên của diserine/threonine và tyrosine protein kinase (DSTYK) đã được quan sát thấy trong quá trình sống sót của bệnh nhân TNBC được điều trị bằng thuốc chống ung thư. Hơn nữa, việc ức chế DSTYK bằng CRISPR/Cas9 đã làm tăng đáng kể quá trình apoptosis của các tế bào ung thư kháng thuốc trong ống nghiệm (tế bào SUM102PT và tế bào MDA-MB-468) và mô hình TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Mặc dù TNBC có sự hoạt hóa bất thường của con đường MAPK, nhưng hiệu quả lâm sàng của các liệu pháp nhắm mục tiêu MEK lại kém. Một sàng lọc thư viện gen CRISPR/Cas9 đã tiết lộ rằng việc ức chế PSMG2 (protein hỗ trợ lắp ráp proteome 2) làm tăng độ nhạy cảm của tế bào TNBC BT549 và MB468 đối với chất ức chế MEK AZD6244. Việc làm giảm biểu hiện PSMG2 bằng CRISPR/Cas9 đã làm thay đổi chức năng proteasome bình thường, dẫn đến sự phân giải PDPK1 thông qua cơ chế tự thực bào, từ đó cải thiện hơn nữa các tế bào khối u trong mô hình chuột TNBC được gây ra bởi AZD6244 (chất ức chế MEK) và MG132 (chất ức chế proteasome). Do đó, các chất ức chế proteasome và MAP kinase (MEK) có thể được sử dụng phối hợp để giảm sự tăng sinh tế bào khối u (Wang X. và cộng sự, 2022).
Hệ thống CRISPR/Cas9 cũng đã được sử dụng để sàng lọc sự mất chức năng gen dẫn đến kháng thuốc ở TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. đã giải thích cơ chế kháng thuốc của các tế bào ung thư được điều trị bằng JQ1, một chất ức chế bromodomain BET (BBDI), trong TNBC. Sử dụng CRISPR/Cas9, họ phát hiện ra rằng việc xóa gen rb1 khiến TNBC trở nên kháng thuốc chống ung thư JQ1. Do đó, chức năng của rb1 rất quan trọng trong đáp ứng với thuốc JQ1 ở TNBC. Họ cũng báo cáo rằng paclitaxel là một chất ức chế kinase/microtubule CDK4/6, và sự kết hợp của nó với các BBDI như JQ1 có thể mang lại phản ứng điều trị đầy hứa hẹn đối với TNBC kháng thuốc (Ge et al., 2020).
Người ta đã báo cáo rằng cấu trúc phiên mã của RNA không mã hóa dài (lncRNA) chịu trách nhiệm cho sự kháng thuốc điều trị tân bổ trợ ở TNBC. Nghiên cứu này cho thấy năm bản sao lncRNA MALAT1 khác nhau được biểu hiện mạnh ở TNBC. Ngoài ra, việc xóa MALAT1 bằng phương pháp CRISPR/Cas9 làm tăng độ nhạy cảm của tế bào TNBC BT-549 đối với paclitaxel và doxorubicin, cho thấy vai trò tiềm tàng của sự kháng thuốc MALAT1 trong TNBC (Shaath et al., 2021).
Các đột biến trong gen BRCA1 (BRCA1m) rất đa dạng và do đó khó phát hiện. Việc nhắm mục tiêu vào PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase), đối tác gây chết tổng hợp của BRCA1, có thể làm tăng độ nhạy cảm của TNBC với thuốc hóa trị. Sử dụng CRISPR/Cas9, việc xóa PARP1 đã làm tăng độ nhạy cảm của các thuốc chống ung thư như doxorubicin, gemcitabine và docetaxel đối với các tế bào TNBC đột biến mBRCA1, cho thấy PARP1 cũng tham gia vào cơ chế kháng thuốc ở TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Các đột biến trong gen ức chế khối u BRCA1 hoặc BRCA2 được biết là làm tăng khả năng phát triển ung thư vú ở người. Việc điều trị cho những bệnh nhân này đòi hỏi phải sử dụng thuốc ức chế PARP. Ngoài ra, người ta đã chứng minh rằng việc loại bỏ yếu tố tái sử dụng nucleotide DNPH1 bằng CRISPR/Cas9 có thể loại bỏ nucleotide độc ​​hại 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU) monophosphate, từ đó tăng cường khả năng đáp ứng của các tế bào thiếu BRCA đối với thuốc ức chế PARP (Fugger và cộng sự, 2021). Do đó, CRISPR/Cas9 và thuốc ức chế PARP1 có thể trở thành một chiến lược điều trị quan trọng cho TNBC.
Gen glycoprotein thâm nhập (P-gp) là một gen kháng thuốc đa dạng, thường được biểu hiện quá mức ở khoảng 41% tất cả các trường hợp ung thư vú ba âm tính (TNBC) (Sun và cộng sự, 2020). Sự vận chuyển thuốc ra ngoài tế bào do P-gp gây ra đã được xác định là yếu tố điều hòa quan trọng của tình trạng kháng thuốc trong ung thư vú. Các chất ức chế P-gp đã chứng minh khả năng tăng nhạy cảm với thuốc chống ung thư trong ung thư vú (Famta và cộng sự, 2021). Do đó, việc loại bỏ hoặc ức chế P-gp và các chất ức chế P-gp bằng phương pháp CRISPR/Cas9 có thể là những phương pháp rất quan trọng để khắc phục tình trạng kháng thuốc trong TNBC.
Chất vận chuyển cassette liên kết ATP G2 (ABCG2) được biết là gây ra tình trạng kháng thuốc ở TNBC (Palasuberniam et al., 2015), mặc dù hiện chưa có báo cáo nào về mối liên hệ giữa CRISPR/Cas9 và việc làm im lặng ABCG2 cũng như sự bất hoạt gen ức chế khối u. PTEN có thể tăng cường hoạt hóa ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Do đó, việc sử dụng CRISPR/Cas9 để loại bỏ ABCG2 và kết hợp với chất ức chế ABCG2 có thể là một phương pháp điều trị thích hợp để khắc phục tình trạng kháng thuốc ở TNBC. Bảng 2 đề cập đến việc CRISPR/Cas9 nhắm mục tiêu vào tất cả các gen kháng thuốc.
Bảng 2. Hệ thống CRISPR/Cas9 nhắm mục tiêu vào các gen kháng thuốc TNBC khác nhau để tăng độ nhạy cảm của tế bào với thuốc chống ung thư.
Các thư viện CRISPR/Cas9 là công cụ tiềm năng để sàng lọc các đột biến gen liên quan đến bệnh sinh ung thư (Chan et al., 2022). Phương pháp sàng lọc này bao gồm bốn bước như (a) xây dựng thư viện, (b) truyền tải lentivirus, (c) sàng lọc kiểu hình và (d) phân tích gen đích. Mặc dù TNBC có sự hoạt hóa bất thường của con đường MAPK, nhưng tiên lượng lâm sàng của liệu pháp nhắm mục tiêu MEK đối với bệnh nhân TNBC mang đột biến trong các gen ức chế khối u như PTEN, RB1 và ​​TP53 là rất kém.
Ngoài ra, một sàng lọc loại bỏ gen bằng CRISPR/Cas9 đã thử nghiệm phân tử mạnh nhất và có tính chọn lọc cao, dehydrocatrol, có nhiều trong chiết xuất hoa và lá của Guatemala, để hiểu tác dụng của dehydrocatrol trên tế bào MDA-MB-231. Cơ chế gây độc tế bào có chọn lọc. Đặc điểm tế bào gốc trung mô của các phân nhóm TNBC. Sàng lọc dựa trên CRISPR/Cas9 này cũng tiết lộ rằng HSD17B11, một gen mã hóa 17β-hydroxysteroid dehydrogenase loại 11, được biểu hiện cao trong tế bào MDA-MB-231 và tạo ra dehydrofalcarinol đặc hiệu cho tế bào MDA-MB-231 (Grant và cộng sự, 2020). Do đó, điều này cho thấy sàng lọc gen bằng CRISPR/Cas9 có tiềm năng lớn trong việc xác định các cơ chế cơ bản của đặc tính chống ung thư của các hợp chất tự nhiên tiềm năng.
Ngoài ra, tính dễ bị tổn thương của TNBC đối với ung thư đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng sàng lọc CRISPR/Cas9 toàn bộ hệ gen không thiên vị trên cơ thể sống, cho thấy mối liên hệ giữa các con đường sinh ung thư và ức chế khối u. Các thành phần chính của con đường mTOR và Hippo được báo cáo là đóng vai trò quan trọng trong điều hòa khối u ở TNBC. Thêm vào đó, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc ức chế dược lý mTORC1/2 và protein sinh ung thư YAP có hiệu quả trong việc ức chế khả năng gây bệnh của TNBC bằng cách sử dụng mô hình hiệp đồng thuốc-ma trận trong ống nghiệm và mô hình ghép tế bào ung thư từ bệnh nhân trên cơ thể sống. Hơn nữa, sự ức chế mTORC1/2 do Torin-1 làm trung gian giúp tăng cường quá trình thực bào lớn, trong khi sự ức chế YAP do verteporfin gây ra dẫn đến chết tế bào TNBC. Tóm lại, những kết quả này nhấn mạnh sức mạnh và tính ổn định của sàng lọc CRISPR toàn bộ hệ gen trên cơ thể sống để xác định các phương pháp điều trị mới và hiệu quả cho TNBC (Dai et al., 2021).
Sự rối loạn chức năng của hệ miễn dịch là một yếu tố quan trọng trong quá trình hình thành khối u. Các tế bào ung thư né tránh sự thanh lọc của hệ miễn dịch bằng cách vượt qua các cơ chế phòng vệ, bao gồm cả việc can thiệp vào hoạt động của các tế bào miễn dịch trong môi trường vi mô khối u và làm suy yếu hệ miễn dịch. Do đó, phát triển một hệ miễn dịch được cải thiện có thể là một phương pháp quan trọng để chống lại khối u. Việc sử dụng phương pháp chỉnh sửa gen dựa trên CRISPR/Cas9 giải quyết một số vấn đề liên quan đến rối loạn chức năng miễn dịch từ nhiều khía cạnh khác nhau. CRISPR/Cas9 đã được sử dụng để cải thiện khả năng miễn dịch chống khối u đối với ung thư vú thông qua các con đường sau (Hình 3).
Hình 3. Liệu pháp miễn dịch CRISPR/Cas9 nhắm mục tiêu vào các tế bào TNBC. Việc mất CDK5 và ức chế PDL1 và CD155 giúp tăng cường hệ thống miễn dịch. Tương tự, việc mất A2AR và ức chế các TAA như HER2, mucin 1 và TEM8 làm tăng hiệu quả của tế bào CAR-T trong việc tiêu diệt tế bào ung thư. Sàng lọc tế bào T bằng CRISPR/Cas9 đã cho thấy rằng việc phá vỡ kinase p38 làm tăng hoạt động chống khối u của tế bào T. Các tế bào T được biến đổi bằng CRISPR/Cas9 làm tăng biểu hiện TCR (thụ thể tế bào T), dẫn đến các tế bào T có hoạt động chống khối u.
Mục tiêu của liệu pháp miễn dịch là kích thích hệ thống miễn dịch tấn công các tế bào ung thư. Sự biểu hiện quá mức của các protein điểm kiểm soát miễn dịch thường ngăn ngừa các phản ứng tự miễn dịch nhưng có thể giúp ung thư tránh được chúng (Topalian và cộng sự, 2015). Các protein này ngăn chặn các phản ứng miễn dịch bằng cách liên kết với các thụ thể trên bề mặt của các tế bào miễn dịch. Nhiều protein điểm kiểm soát (như CD155 và PD-L1) nhắm mục tiêu vào thụ thể PD-1 trên các tế bào miễn dịch và được biểu hiện trong ung thư vú, đặc biệt là TNBC (Li Y.-C. và cộng sự, 2020). Việc ức chế PD-L1 hoặc thụ thể của nó bằng CRISPR/Cas9 có thể kích thích hệ thống miễn dịch tấn công các khối u TNBC (Yahata và cộng sự, 2019). Ngoài ra, việc giảm biểu hiện PD-L1 thông qua việc xóa CDK5 bằng CRISPR/Cas9 đã được chứng minh là có thể ức chế sự phát triển của khối u trong ống nghiệm và trên động vật (Deng và cộng sự, 2020). Việc ức chế sự phát triển trong các mô hình ung thư vú trong ống nghiệm và trên động vật cho thấy rằng việc giảm CD155 thông qua shRNA có thể có tác dụng điều trị đối với ung thư vú (Gao et al., 2018).
Tế bào CAR T biểu hiện CAR nhận diện các kháng nguyên liên quan đến khối u (TAA) và có thể sử dụng phương pháp ức chế protein điểm kiểm soát để tăng cường hoạt động của chúng (Li C. và cộng sự, 2020). Có nhiều mục tiêu tiềm năng cho liệu pháp tế bào CAR T trong điều trị ung thư vú, bao gồm một số TAA như HER2, mucin1 và TEM8 (Bajgain và cộng sự, 2018). Có bằng chứng cho thấy tế bào CAR T nhắm mục tiêu vào mesothelin (biểu hiện quá mức trong tế bào TNBC BT-459) hiệu quả hơn trong điều trị ung thư khi PD-1 bị loại bỏ bằng CRISPR/Cas9 (Hu và cộng sự, 2019). Tuy nhiên, việc phân lập tế bào T từ bệnh nhân và sau đó chỉnh sửa chúng ngoài cơ thể là một quá trình tốn nhiều công sức và thời gian. Mặc dù tế bào T phổ quát có thể giảm bớt yêu cầu phân lập, nhưng các tế bào T của người hiến tặng biểu hiện kháng nguyên bạch cầu người (HLA) lớp I và thụ thể tế bào T (TCR) cần được loại bỏ để ngăn ngừa các bất thường ghép chống chủ (Ren và cộng sự, 2017, 2017a). Sử dụng CRISPR/Cas9, HDR có thể đồng thời loại bỏ TCR và HLA và loại bỏ gen mã hóa CAR. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng CRISPR/Cas9 có thể được sử dụng để đưa CAR kháng CD19 vào vị trí TCR, từ đó sản xuất CAR một cách hiệu quả mà không làm suy giảm tế bào T (Dimitri et al., 2022). Các công nghệ đa kênh đã được phát triển để tạo ra tế bào T CAR dị loại bằng cách đồng thời loại bỏ TCR, beta-2-microglobulin (B2M), tiểu đơn vị HLA-I và các protein khác như PD-1 và CTLA-4, có thể có đặc tính chống ung thư mạnh hơn đối với TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Việc sử dụng CRISPR/Cas9 có thể cải thiện hiệu quả của tế bào CAR-T. Adenosine được biết đến là có đặc tính ức chế miễn dịch và có thể làm giảm khả năng miễn dịch chống ung thư bằng cách ngăn chặn chức năng tế bào T và kích hoạt thụ thể adenosine A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Việc làm im lặng A2AR bằng CRISPR/Cas9 đã cải thiện đáng kể hiệu quả của tế bào CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Tế bào T được biết là thể hiện nhiều đặc điểm kiểu hình khác nhau như sự tăng sinh tế bào, biệt hóa, stress oxy hóa và stress gen. Sàng lọc tế bào T dựa trên CRISPR/Cas9 đã tiết lộ sự gián đoạn của 25 loại kinase thụ thể tế bào T khác nhau. Trong số đó, việc xóa bỏ kinase p38 đã được chứng minh là làm tăng hoạt động chống khối u của tế bào T, cho thấy kinase p38 là một yếu tố điều hòa quan trọng trong việc điều hòa tế bào CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Tế bào T có thể được biến đổi gen bằng CRISPR/Cas9 để tạo ra các TCR biểu hiện cao. Việc truyền tế bào T biến đổi gen cho bệnh nhân đã cho thấy hoạt tính chống ung thư mạnh hơn so với tế bào T nội sinh. Do đó, các TCR nội sinh có thể cạnh tranh với các TCR biến đổi gen ở bệnh nhân, điều này có thể ảnh hưởng đến tiềm năng của liệu pháp miễn dịch ung thư. Để khắc phục vấn đề này, việc sử dụng CRISPR/Cas9 để loại bỏ TCR-β nội sinh trong tế bào nhận và sau đó truyền tế bào T TCR-β cho bệnh nhân ung thư có thể cho thấy phản ứng miễn dịch chống ung thư tốt hơn mà không cần sự cạnh tranh sinh sản của TCR nội sinh (Fan et al. 2018). Như vậy, ngoại trừ các tế bào T biến đổi bằng CRISPR, TCR nhạy cảm với kháng nguyên khối u gấp nghìn lần so với các tế bào T được chuyển gen TCR bình thường. Ngoài ra, trong nhiều bệnh bạch cầu, các tế bào T biến đổi được tạo ra bằng CRISPR γδ TCR+ biểu hiện tế bào T CD4+ và CD8+ cao hơn so với phương pháp chuyển gen TCR tiêu chuẩn (Legut et al., 2018). Do đó, tế bào T được biến đổi gen bằng công nghệ CRISPR/Cas9 có thể là một phương pháp miễn dịch trị liệu hiệu quả để khắc phục ung thư vú ba âm tính (TNBC).
Integrin là các phân tử kết dính tế bào có mặt trong màng tế bào và thúc đẩy sự liên kết của tế bào với chất nền ngoại bào (ECM) (Hamidi và Ivaska, 2018). Sự rối loạn chức năng của integrin có liên quan đến sự phát triển và di căn của ung thư bằng cách làm thay đổi chất nền ngoại bào, dẫn đến sự sống sót của tế bào ung thư trong tuần hoàn máu (Hamidi và Ivaska, 2018). Việc ức chế integrin bằng CRISPR/Cas9 làm chậm sự tiến triển, di căn và xâm lấn của khối u trong TNBC. Việc ức chế integrin α5 (ITGA5) đã được báo cáo là làm giảm sự di chuyển và tiến triển của tế bào trong các loại ung thư khác như ung thư phổi (Ju et al., 2017), cho thấy rằng integrin α5 cũng có thể là một yếu tố quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của TNBC.
Việc tạo ra chuột đột biến gen bằng các phương pháp tế bào gốc phôi (ES) truyền thống là một quá trình tốn nhiều công sức, thời gian và không hiệu quả. Phải mất hàng tháng, thậm chí hàng năm để nhắm mục tiêu vào tế bào ES thông qua tái tổ hợp tương đồng, lai tạo chuột lai, và sau đó lai chúng với chuột dị hợp tử để tạo ra con cái đồng hợp tử. Cần phải lai tạo phức tạp để tạo ra chuột mang nhiều đột biến gen. Tuy nhiên, nhiều vấn đề đã phát sinh khi sử dụng chuột được tạo ra bằng cách loại bỏ tế bào ES bằng CRISPR/Cas9 hoặc bằng cách tiêm vi mô các thành phần CRISPR/Cas9 vào trứng đã thụ tinh đơn bào. Ví dụ, việc đưa vào các thay đổi thường xảy ra ở các vị trí lưỡng alen và không đặc hiệu cho từng gen. Gần đây, người ta đã báo cáo rằng tế bào ES sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 có thể đồng thời chèn các đột biến lưỡng alen vào tối đa 5 gen (Nishizono et al., 2021). Để làm được điều này, mRNA Cas9 và năm gRNA đặc hiệu cho từng gen đã được chuyển đồng thời vào tế bào ES. Điều này làm nổi bật tiềm năng và hiệu quả của quy trình này, mặc dù những đột biến này có thể đã được truyền lại khi các dòng chuột nền được lai tạo để tạo ra chuột đột biến gen kép. Nghiên cứu cũng báo cáo một phát hiện đáng ngạc nhiên: tế bào gốc phôi (ES) không còn cần thiết để tạo ra chuột biến đổi gen. Thay vào đó, để loại bỏ các sản phẩm gen cụ thể, mRNA Cas9 và gRNA được tiêm vào phôi ở giai đoạn tế bào đơn. Kết quả là, các dòng chuột nền đột biến gen đã được tạo ra, về mặt lý thuyết có thể được sử dụng để nghiên cứu hậu quả của việc xóa gen ở chuột (Qin và cộng sự, 2016). Như vậy, CRISPR/Cas9 cho phép tạo ra chuột chuyển gen để điều trị ung thư vú ba âm tính (TNBC) với chi phí thấp hơn so với kỹ thuật di truyền truyền thống. Sử dụng hệ thống CRISPR/Cas, một mô hình chuột đột biến gen mới đã được phát triển, có thể thành công trong việc đưa các đột biến điểm vào một hoặc nhiều gen nội sinh trong TNBC. Dựa trên khái niệm này, các mô hình động vật của TNBC cũng có thể được phát triển bằng cách sử dụng phương pháp xóa BRCA1 và p53 thông qua CRISPR/Cas9, dẫn đến mất khả năng sửa chữa HR, mất ổn định bộ gen và kiểu hình đột biến (Annunziato et al., 2020).
Hiện nay, nhiều phương pháp như chụp nhũ ảnh, chụp cộng hưởng từ (MRI) và siêu âm được sử dụng để chẩn đoán ung thư vú ba âm tính (TNBC). Tuy nhiên, các phương pháp này đều có một số hạn chế. Chụp nhũ ảnh được sử dụng để chẩn đoán mô vú tại chỗ chứ không phải di căn, nơi các tế bào ung thư đã di chuyển đến các cơ quan khác. Siêu âm không phải là phương pháp đáng tin cậy để chẩn đoán TNBC (Chen và Lee-Felker, 2023). MRI có độ nhạy cao hơn siêu âm và chụp nhũ ảnh, nhưng độ chính xác chẩn đoán của nó bị hạn chế (Sha và Chen, 2022). Sinh thiết mô là một phương pháp xâm lấn để xác định tế bào ung thư. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, sinh thiết có thể bỏ sót mô ung thư nếu kim đi lạc khỏi vùng cần quan sát. Ngoài ra, phương pháp này rất tốn kém và có thể gây tổn thương cho bệnh nhân. TNBC là một loại ung thư không đồng nhất, vì vậy sinh thiết có thể không cung cấp đủ thông tin về loại ung thư. Do đó, cần khẩn cấp một phương pháp chẩn đoán mới đáng tin cậy để phát hiện TNBC. CRISPR/Cas9 có thể đóng vai trò là một phương pháp thay thế có độ nhạy cao và ít xâm lấn để chẩn đoán ung thư vú. Để đạt được mục tiêu này, các chiến lược dựa trên CRISPR/Cas9 có thể được sử dụng để cải thiện các phương pháp PCR trong chẩn đoán TNBC. Đầu tiên, protein Cas9 và cpf1 của hệ thống CRISPR được sử dụng để loại bỏ DNA không đặc hiệu, sau đó hai protein này (Cas9 và cpf1) có thể nhận diện trình tự PAM trước khi liên kết với DNA đích (Deepak Singh và cộng sự, 2021). Do đó, PCR có thể xác định các đột biến liên quan đến sự phát triển của ung thư. Một số nghiên cứu đã áp dụng chiến lược dựa trên CRISPR này để phát hiện các đột biến khác nhau trong các loại ung thư khác nhau (Safari và cộng sự, 2019). Vì vậy, các phương pháp PCR dựa trên CRISPR có thể làm giảm sự phụ thuộc của chẩn đoán TNBC vào các phương pháp xâm lấn như hóa mô miễn dịch dựa trên sinh thiết.
Những thay đổi về kiểu gen trong điều hòa thụ thể hormone cũng đã được chứng minh ở TNBC (Chen và Russo, 2009). Các chiến lược PCR dựa trên CRISPR/Cas9 sử dụng vi mảng để chẩn đoán tại chỗ có thể theo dõi hiệu quả các đột biến này (Hajian và cộng sự, 2019). Nó cũng có thể cung cấp cho các nhà cung cấp dịch vụ chăm sóc sức khỏe thông tin liên quan về các đột biến cụ thể ở bệnh nhân TNBC, giúp cải thiện quá trình điều trị của họ. Tuy nhiên, kỹ thuật kết hợp này có những hạn chế. Do đó, cần có những nỗ lực nghiên cứu sâu rộng hơn trước khi phương pháp CRISPR/Cas-PCR này có thể được sử dụng trong chăm sóc sức khỏe để chẩn đoán TNBC (Yang và cộng sự, 2019).