Chẩn đoán phân biệt các nốt phổi được xác định bằng chụp cắt lớp vi tính (CT) vẫn là một thách thức trong thực tiễn lâm sàng. Ở đây, chúng tôi mô tả đặc điểm chuyển hóa toàn cầu của 480 mẫu huyết thanh, bao gồm nhóm đối chứng khỏe mạnh, các nốt phổi lành tính và ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I. Ung thư biểu mô tuyến phổi thể hiện các hồ sơ chuyển hóa độc đáo, trong khi các nốt lành tính và người khỏe mạnh có sự tương đồng cao về hồ sơ chuyển hóa. Trong nhóm khám phá (n = 306), một tập hợp 27 chất chuyển hóa đã được xác định để phân biệt giữa các nốt lành tính và ác tính. Diện tích dưới đường cong (AUC) của mô hình phân biệt trong nhóm thẩm định nội bộ (n = 104) và nhóm thẩm định bên ngoài (n = 111) lần lượt là 0,915 và 0,945. Phân tích đường dẫn cho thấy sự gia tăng các chất chuyển hóa đường phân liên quan đến sự giảm tryptophan trong huyết thanh ung thư biểu mô tuyến phổi so với các nốt lành tính và nhóm đối chứng khỏe mạnh, và cho thấy rằng sự hấp thụ tryptophan thúc đẩy quá trình đường phân trong các tế bào ung thư phổi. Nghiên cứu của chúng tôi nhấn mạnh giá trị của các dấu ấn sinh học chuyển hóa trong huyết thanh trong việc đánh giá nguy cơ hình thành các nốt phổi được phát hiện bằng chụp CT.
Chẩn đoán sớm đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân ung thư. Kết quả từ Thử nghiệm sàng lọc ung thư phổi quốc gia Hoa Kỳ (NLST) và Nghiên cứu NELSON của Châu Âu đã chỉ ra rằng sàng lọc bằng chụp cắt lớp vi tính liều thấp (LDCT) có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do ung thư phổi ở các nhóm nguy cơ cao1,2,3. Kể từ khi LDCT được sử dụng rộng rãi để sàng lọc ung thư phổi, tỷ lệ phát hiện tình cờ các nốt phổi không triệu chứng trên phim chụp X-quang tiếp tục tăng lên4. Các nốt phổi được định nghĩa là các vùng mờ khu trú có đường kính lên đến 3 cm5. Chúng ta gặp khó khăn trong việc đánh giá khả năng ác tính và xử lý số lượng lớn các nốt phổi được phát hiện tình cờ trên LDCT. Những hạn chế của CT có thể dẫn đến việc phải khám lại thường xuyên và kết quả dương tính giả, dẫn đến can thiệp không cần thiết và điều trị quá mức6. Do đó, cần phải phát triển các dấu ấn sinh học đáng tin cậy và hữu ích để xác định chính xác ung thư phổi ở giai đoạn sớm và phân biệt hầu hết các nốt lành tính khi phát hiện ban đầu7.
Phân tích phân tử toàn diện máu (huyết thanh, huyết tương, tế bào đơn nhân máu ngoại vi), bao gồm cả hệ gen học, protein học hoặc methyl hóa DNA8,9,10, đã dẫn đến sự quan tâm ngày càng tăng đối với việc phát hiện các dấu ấn sinh học chẩn đoán ung thư phổi. Trong khi đó, các phương pháp chuyển hóa học đo lường các sản phẩm cuối cùng của tế bào bị ảnh hưởng bởi các tác động nội sinh và ngoại sinh, do đó được áp dụng để dự đoán sự khởi phát và kết quả của bệnh. Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS) là một phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu chuyển hóa học do độ nhạy cao và phạm vi động lớn, có thể bao phủ các chất chuyển hóa với các tính chất lý hóa khác nhau11,12,13. Mặc dù phân tích chuyển hóa học toàn cầu của huyết tương/huyết thanh đã được sử dụng để xác định các dấu ấn sinh học liên quan đến chẩn đoán ung thư phổi14,15,16,17 và hiệu quả điều trị,18 nhưng các phân loại chất chuyển hóa trong huyết thanh để phân biệt giữa các nốt phổi lành tính và ác tính vẫn cần được nghiên cứu thêm.
Ung thư biểu mô tuyến và ung thư biểu mô vảy là hai phân nhóm chính của ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC). Nhiều xét nghiệm sàng lọc bằng chụp CT cho thấy ung thư biểu mô tuyến là loại mô học phổ biến nhất của ung thư phổi1,19,20,21. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao - phổ khối lượng độ phân giải cao (UPLC-HRMS) để thực hiện phân tích chuyển hóa trên tổng số 695 mẫu huyết thanh, bao gồm nhóm đối chứng khỏe mạnh, các nốt phổi lành tính và các khối u phổi có kích thước ≤3 cm được phát hiện bằng chụp CT. Sàng lọc ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I. Chúng tôi đã xác định được một nhóm các chất chuyển hóa trong huyết thanh có khả năng phân biệt ung thư biểu mô tuyến phổi với các nốt lành tính và nhóm đối chứng khỏe mạnh. Phân tích làm giàu con đường chuyển hóa cho thấy sự chuyển hóa tryptophan và glucose bất thường là những thay đổi phổ biến ở ung thư biểu mô tuyến phổi so với các nốt lành tính và nhóm đối chứng khỏe mạnh. Cuối cùng, chúng tôi đã thiết lập và xác nhận một bộ phân loại chuyển hóa huyết thanh với độ đặc hiệu và độ nhạy cao để phân biệt giữa các nốt phổi ác tính và lành tính được phát hiện bằng LDCT, điều này có thể hỗ trợ chẩn đoán phân biệt sớm và đánh giá rủi ro.
Trong nghiên cứu hiện tại, các mẫu huyết thanh được thu thập hồi cứu từ 174 người khỏe mạnh, 292 bệnh nhân có u phổi lành tính và 229 bệnh nhân mắc ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I, được lựa chọn sao cho phù hợp về giới tính và tuổi tác. Đặc điểm nhân khẩu học của 695 đối tượng được trình bày trong Bảng bổ sung 1.
Như thể hiện trong Hình 1a, tổng cộng 480 mẫu huyết thanh, bao gồm 174 mẫu đối chứng khỏe mạnh (HC), 170 mẫu u lành tính (BN) và 136 mẫu ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I (LA), đã được thu thập tại Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen. Nhóm nghiên cứu khám phá được sử dụng để phân tích chuyển hóa không định hướng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phổ khối lượng độ phân giải cao (UPLC-HRMS). Như thể hiện trong Hình bổ sung 1, các chất chuyển hóa khác biệt giữa LA và HC, LA và BN đã được xác định để thiết lập mô hình phân loại và tiếp tục khám phá phân tích con đường khác biệt. 104 mẫu được thu thập bởi Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen và 111 mẫu được thu thập bởi hai bệnh viện khác đã được tiến hành thẩm định nội bộ và bên ngoài.
a. Quần thể nghiên cứu trong nhóm khám phá đã trải qua phân tích chuyển hóa huyết thanh toàn cầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cực cao - phổ khối lượng độ phân giải cao (UPLC-HRMS). b. Phân tích phân biệt bình phương tối thiểu từng phần (PLS-DA) của toàn bộ hệ thống chuyển hóa của 480 mẫu huyết thanh từ nhóm nghiên cứu, bao gồm nhóm đối chứng khỏe mạnh (HC, n = 174), u lành tính (BN, n = 170) và ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I (Los Angeles, n = 136). +ESI, chế độ ion hóa phun điện dương, -ESI, chế độ ion hóa phun điện âm. c–e. Các chất chuyển hóa có sự khác biệt đáng kể về nồng độ giữa hai nhóm nhất định (kiểm định Wilcoxon xếp hạng có dấu hai phía, giá trị p được điều chỉnh theo tỷ lệ phát hiện sai, FDR <0,05) được hiển thị bằng màu đỏ (thay đổi gấp > 1,2) và màu xanh lam (thay đổi gấp < 0,83). f Bản đồ nhiệt phân cụm phân cấp thể hiện sự khác biệt đáng kể về số lượng chất chuyển hóa được chú thích giữa LA và BN. Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng các tệp dữ liệu nguồn.
Toàn bộ hệ thống chuyển hóa huyết thanh của 174 người khỏe mạnh (HC), 170 người mắc bệnh BN và 136 người mắc bệnh LA trong nhóm nghiên cứu đã được phân tích bằng phương pháp UPLC-HRMS. Đầu tiên, chúng tôi chỉ ra rằng các mẫu kiểm soát chất lượng (QC) tập trung chặt chẽ ở trung tâm của mô hình phân tích thành phần chính (PCA) không giám sát, xác nhận tính ổn định của hiệu suất nghiên cứu hiện tại (Hình bổ sung 2).
Như thể hiện trong phân tích phân biệt bình phương tối thiểu từng phần (PLS-DA) ở Hình 1b, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa LA và BN, LA và HC ở chế độ ion hóa phun điện dương (+ESI) và âm (−ESI). Tuy nhiên, không tìm thấy sự khác biệt đáng kể giữa BN và HC trong điều kiện +ESI và -ESI.
Chúng tôi đã tìm thấy 382 đặc điểm khác biệt giữa LA và HC, 231 đặc điểm khác biệt giữa LA và BN, và 95 đặc điểm khác biệt giữa BN và HC (kiểm định Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 và thay đổi bội >1,2 hoặc <0,83) (Hình 1c-e). Các đỉnh được chú thích thêm (Dữ liệu bổ sung 3) dựa trên cơ sở dữ liệu (thư viện mzCloud/HMDB/Chemspider) bằng giá trị m/z, thời gian lưu giữ và tìm kiếm phổ khối phân mảnh (chi tiết được mô tả trong phần Phương pháp) 22. Cuối cùng, 33 và 38 chất chuyển hóa được chú thích có sự khác biệt đáng kể về độ phong phú đã được xác định cho LA so với BN (Hình 1f và Bảng bổ sung 2) và LA so với HC (Hình bổ sung 3 và Bảng bổ sung 2), tương ứng. Ngược lại, chỉ có 3 chất chuyển hóa có sự khác biệt đáng kể về độ phong phú được xác định trong BN và HC (Bảng bổ sung 2), phù hợp với sự chồng chéo giữa BN và HC trong PLS-DA. Các chất chuyển hóa khác biệt này bao gồm một loạt các chất sinh hóa (Hình bổ sung 4). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy những thay đổi đáng kể trong hệ chuyển hóa huyết thanh phản ánh sự chuyển đổi ác tính của ung thư phổi giai đoạn sớm so với các nốt phổi lành tính hoặc người khỏe mạnh. Trong khi đó, sự tương đồng về hệ chuyển hóa huyết thanh của BN và HC cho thấy các nốt phổi lành tính có thể chia sẻ nhiều đặc điểm sinh học với người khỏe mạnh. Vì đột biến gen thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) phổ biến ở ung thư biểu mô tuyến phổi phân nhóm 23, chúng tôi đã tìm cách xác định tác động của các đột biến chủ đạo lên hệ chuyển hóa huyết thanh. Sau đó, chúng tôi đã phân tích hồ sơ chuyển hóa tổng thể của 72 trường hợp có tình trạng EGFR trong nhóm ung thư biểu mô tuyến phổi. Điều thú vị là, chúng tôi nhận thấy hồ sơ tương đương giữa bệnh nhân đột biến EGFR (n = 41) và bệnh nhân EGFR kiểu hoang dã (n = 31) trong phân tích PCA (Hình bổ sung 5a). Tuy nhiên, chúng tôi đã xác định được 7 chất chuyển hóa có nồng độ thay đổi đáng kể ở bệnh nhân đột biến EGFR so với bệnh nhân có EGFR kiểu hoang dã (kiểm định t, p < 0,05 và thay đổi gấp > 1,2 hoặc < 0,83) (Hình bổ sung 5b). Phần lớn các chất chuyển hóa này (5 trong số 7) là acylcarnitine, đóng vai trò quan trọng trong các con đường oxy hóa axit béo.
Như minh họa trong quy trình làm việc ở Hình 2a, các dấu ấn sinh học để phân loại nốt sần được thu thập bằng cách sử dụng toán tử co rút tuyệt đối nhỏ nhất (LASSO) và lựa chọn dựa trên 33 chất chuyển hóa khác biệt được xác định trong LA (n = 136) và BN (n = 170). Mô hình hồi quy logistic nhị phân (LASSO) – sự kết hợp tốt nhất của các biến. Phương pháp kiểm định chéo 10 lần được sử dụng để kiểm tra độ tin cậy của mô hình. Việc lựa chọn biến và điều chỉnh tham số được điều chỉnh bằng hình phạt tối đa hóa khả năng với tham số λ24. Phân tích chuyển hóa toàn cầu được thực hiện độc lập trong nhóm thẩm định nội bộ (n = 104) và nhóm thẩm định bên ngoài (n = 111) để kiểm tra hiệu suất phân loại của mô hình phân biệt. Kết quả là, 27 chất chuyển hóa trong tập dữ liệu khám phá được xác định là mô hình phân biệt tốt nhất với giá trị AUC trung bình lớn nhất (Hình 2b), trong đó 9 chất có hoạt động tăng và 18 chất có hoạt động giảm trong LA so với BN (Hình 2c).
Quy trình xây dựng bộ phân loại nốt phổi, bao gồm việc lựa chọn nhóm chất chuyển hóa huyết thanh tốt nhất trong tập dữ liệu khám phá bằng mô hình hồi quy logistic nhị phân thông qua phương pháp kiểm định chéo mười lần và đánh giá hiệu suất dự đoán trong các tập dữ liệu kiểm định nội bộ và bên ngoài. b Thống kê kiểm định chéo của mô hình hồi quy LASSO để lựa chọn dấu ấn sinh học chuyển hóa. Các con số được đưa ra ở trên thể hiện số lượng dấu ấn sinh học trung bình được chọn ở một λ nhất định. Đường chấm đỏ thể hiện giá trị AUC trung bình ở lambda tương ứng. Các thanh lỗi màu xám thể hiện giá trị AUC tối thiểu và tối đa. Đường chấm biểu thị mô hình tốt nhất với 27 dấu ấn sinh học được chọn. AUC, diện tích dưới đường cong đặc tính hoạt động của bộ thu (ROC). c Thay đổi gấp nhiều lần của 27 chất chuyển hóa được chọn trong nhóm LA so với nhóm BN trong nhóm khám phá. Cột màu đỏ – kích hoạt. Cột màu xanh lam là sự suy giảm. d–f Đường cong đặc tính hoạt động của bộ thu (ROC) thể hiện sức mạnh của mô hình phân biệt dựa trên 27 tổ hợp chất chuyển hóa trong các tập dữ liệu khám phá, kiểm định nội bộ và bên ngoài. Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng các tệp dữ liệu nguồn.
Một mô hình dự đoán đã được tạo ra dựa trên các hệ số hồi quy có trọng số của 27 chất chuyển hóa này (Bảng bổ sung 3). Phân tích ROC dựa trên 27 chất chuyển hóa này cho giá trị diện tích dưới đường cong (AUC) là 0,933, độ nhạy của nhóm phát hiện là 0,868 và độ đặc hiệu là 0,859 (Hình 2d). Trong khi đó, trong số 38 chất chuyển hóa khác biệt được chú thích giữa LA và HC, một tập hợp gồm 16 chất chuyển hóa đạt AUC là 0,902 với độ nhạy là 0,801 và độ đặc hiệu là 0,856 trong việc phân biệt LA với HC (Hình bổ sung 6a-c). Giá trị AUC dựa trên các ngưỡng thay đổi gấp khác nhau cho các chất chuyển hóa khác biệt cũng được so sánh. Chúng tôi nhận thấy rằng mô hình phân loại hoạt động tốt nhất trong việc phân biệt giữa LA và BN (HC) khi mức thay đổi gấp được đặt là 1,2 so với 1,5 hoặc 2,0 (Hình bổ sung 7a,b). Mô hình phân loại, dựa trên 27 nhóm chất chuyển hóa, đã được xác thực thêm trong các nhóm đối tượng nội bộ và bên ngoài. AUC đạt 0,915 (độ nhạy 0,867, độ đặc hiệu 0,811) đối với xác thực nội bộ và 0,945 (độ nhạy 0,810, độ đặc hiệu 0,979) đối với xác thực bên ngoài (Hình 2e, f). Để đánh giá hiệu quả giữa các phòng thí nghiệm, 40 mẫu từ nhóm đối tượng bên ngoài đã được phân tích tại một phòng thí nghiệm bên ngoài như mô tả trong phần Phương pháp. Độ chính xác phân loại đạt AUC là 0,925 (Hình bổ sung 8). Vì ung thư biểu mô tế bào vảy phổi (LUSC) là phân nhóm phổ biến thứ hai của ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) sau ung thư biểu mô tuyến phổi (LUAD), chúng tôi cũng đã thử nghiệm khả năng hữu ích tiềm tàng đã được xác thực của hồ sơ chuyển hóa. BN và 16 trường hợp LUSC. AUC phân biệt giữa LUSC và BN là 0,776 (Hình bổ sung 9), cho thấy khả năng kém hơn so với khả năng phân biệt giữa LUAD và BN.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng kích thước của các nốt trên hình ảnh CT có tương quan thuận với khả năng ác tính và vẫn là yếu tố quyết định chính trong điều trị nốt25,26,27. Phân tích dữ liệu từ nhóm lớn của nghiên cứu sàng lọc NELSON cho thấy nguy cơ ác tính ở những người có nốt <5 mm thậm chí còn tương tự như ở những người không có nốt28. Do đó, kích thước tối thiểu cần theo dõi CT thường xuyên là 5 mm, theo khuyến nghị của Hiệp hội Lồng ngực Anh (BTS), và 6 mm, theo khuyến nghị của Hiệp hội Fleischner29. Tuy nhiên, các nốt lớn hơn 6 mm và không có đặc điểm lành tính rõ ràng, được gọi là nốt phổi không xác định (IPN), vẫn là một thách thức lớn trong việc đánh giá và quản lý trong thực hành lâm sàng30,31. Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra xem kích thước nốt có ảnh hưởng đến dấu ấn chuyển hóa hay không bằng cách sử dụng các mẫu gộp từ nhóm khám phá và nhóm xác thực nội bộ. Tập trung vào 27 dấu ấn sinh học đã được xác thực, trước tiên chúng tôi đã so sánh hồ sơ PCA của các chất chuyển hóa dưới 6 mm ở nhóm HC và BN. Chúng tôi nhận thấy hầu hết các điểm dữ liệu của nhóm HC và BN trùng lặp, cho thấy nồng độ chất chuyển hóa trong huyết thanh tương tự nhau ở cả hai nhóm (Hình 3a). Bản đồ đặc trưng trên các phạm vi kích thước khác nhau vẫn được bảo tồn ở nhóm BN và LA (Hình 3b, c), trong khi đó, sự phân tách được quan sát thấy giữa các nốt ác tính và lành tính trong phạm vi 6–20 mm (Hình 3d). Nhóm nghiên cứu này có AUC là 0,927, độ đặc hiệu là 0,868 và độ nhạy là 0,820 để dự đoán tính ác tính của các nốt có kích thước từ 6 đến 20 mm (Hình 3e, f). Kết quả của chúng tôi cho thấy bộ phân loại có thể nắm bắt được những thay đổi chuyển hóa do quá trình chuyển đổi ác tính sớm gây ra, bất kể kích thước nốt.
a So sánh hồ sơ PCA giữa các nhóm được chỉ định dựa trên bộ phân loại chuyển hóa gồm 27 chất chuyển hóa. CC và BN < 6 mm. b BN < 6 mm so với BN 6–20 mm. LA 6–20 mm so với LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm và LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Đường cong đặc tính hoạt động của bộ thu (ROC) cho thấy hiệu suất mô hình phân biệt đối với các nốt 6–20 mm. f Giá trị xác suất được tính toán dựa trên mô hình hồi quy logistic cho các nốt có kích thước 6–20 mm. Đường chấm màu xám biểu thị giá trị ngưỡng tối ưu (0,455). Các con số trên biểu thị tỷ lệ phần trăm các trường hợp được dự kiến cho Los Angeles. Sử dụng kiểm định t Student hai phía. PCA, phân tích thành phần chính. AUC, diện tích dưới đường cong. Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng các tệp dữ liệu nguồn.
Bốn mẫu (tuổi từ 44–61) với kích thước nốt phổi tương tự (7–9 mm) được chọn thêm để minh họa hiệu suất của mô hình dự đoán ác tính được đề xuất (Hình 4a, b). Trong lần sàng lọc ban đầu, Trường hợp 1 được biểu hiện là một nốt đặc có vôi hóa, một đặc điểm liên quan đến lành tính, trong khi Trường hợp 2 được biểu hiện là một nốt bán đặc không xác định, không có đặc điểm lành tính rõ ràng. Ba lần chụp CT theo dõi cho thấy các trường hợp này vẫn ổn định trong suốt 4 năm và do đó được coi là các nốt lành tính (Hình 4a). So với đánh giá lâm sàng của các lần chụp CT liên tiếp, phân tích chất chuyển hóa huyết thanh một lần với mô hình phân loại hiện tại đã nhanh chóng và chính xác xác định các nốt lành tính này dựa trên các ràng buộc xác suất (Bảng 1). Hình 4b trong trường hợp 3 cho thấy một nốt có dấu hiệu co rút màng phổi, thường liên quan đến ác tính32. Trường hợp 4 được biểu hiện là một nốt bán đặc không xác định, không có bằng chứng về nguyên nhân lành tính. Tất cả các trường hợp này đều được dự đoán là ác tính theo mô hình phân loại (Bảng 1). Việc đánh giá ung thư biểu mô tuyến phổi được chứng minh bằng xét nghiệm mô bệnh học sau phẫu thuật cắt bỏ phổi (Hình 4b). Đối với bộ dữ liệu xác thực bên ngoài, bộ phân loại chuyển hóa đã dự đoán chính xác hai trường hợp nốt phổi không xác định có kích thước lớn hơn 6 mm (Hình bổ sung 10).
Hình ảnh CT mặt cắt ngang của phổi trong hai trường hợp u lành tính. Trường hợp 1, chụp CT sau 4 năm cho thấy một u đặc ổn định kích thước 7 mm có vôi hóa ở thùy dưới bên phải. Trường hợp 2, chụp CT sau 5 năm cho thấy một u ổn định, bán đặc với đường kính 7 mm ở thùy trên bên phải. b Hình ảnh CT mặt cắt ngang của phổi và các nghiên cứu bệnh lý tương ứng của hai trường hợp ung thư biểu mô tuyến giai đoạn I trước khi cắt bỏ phổi. Trường hợp 3 cho thấy một u có đường kính 8 mm ở thùy trên bên phải kèm theo co rút màng phổi. Trường hợp 4 cho thấy một u dạng kính mờ bán đặc kích thước 9 mm ở thùy trên bên trái. Nhuộm Hematoxylin và eosin (H&E) mô phổi đã cắt bỏ (thang đo = 50 μm) cho thấy kiểu tăng trưởng dạng nang của ung thư biểu mô tuyến phổi. Mũi tên chỉ các u được phát hiện trên hình ảnh CT. Hình ảnh H&E là hình ảnh đại diện của nhiều (>3) trường hiển vi được nhà bệnh lý học kiểm tra.
Tóm lại, kết quả của chúng tôi chứng minh giá trị tiềm tàng của các dấu ấn sinh học chuyển hóa trong huyết thanh trong chẩn đoán phân biệt các nốt phổi, điều này có thể gây khó khăn khi đánh giá sàng lọc bằng chụp CT.
Dựa trên bảng phân tích chất chuyển hóa khác biệt đã được xác thực, chúng tôi đã tìm cách xác định các mối tương quan sinh học của những thay đổi chuyển hóa chính. Phân tích làm giàu đường dẫn KEGG bằng MetaboAnalyst đã xác định được 6 đường dẫn bị thay đổi đáng kể phổ biến giữa hai nhóm đã cho (LA so với HC và LA so với BN, p điều chỉnh ≤ 0,001, hiệu ứng > 0,01). Những thay đổi này được đặc trưng bởi sự rối loạn trong chuyển hóa pyruvate, chuyển hóa tryptophan, chuyển hóa niacin và nicotinamide, đường phân, chu trình TCA và chuyển hóa purine (Hình 5a). Sau đó, chúng tôi tiếp tục thực hiện phân tích chuyển hóa mục tiêu để xác minh những thay đổi chính bằng cách định lượng tuyệt đối. Xác định các chất chuyển hóa phổ biến trong các đường dẫn bị thay đổi phổ biến bằng phương pháp đo phổ khối tứ cực ba lần (QQQ) sử dụng các chất chuẩn chuyển hóa đích thực. Đặc điểm nhân khẩu học của mẫu mục tiêu nghiên cứu chuyển hóa học được trình bày trong Bảng bổ sung 4. Phù hợp với kết quả chuyển hóa học tổng thể của chúng tôi, phân tích định lượng đã xác nhận rằng hypoxanthine, xanthine, pyruvate và lactate tăng lên ở nhóm LA so với nhóm BN và HC (Hình 5b, c, p <0,05). Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể nào về các chất chuyển hóa này giữa nhóm BN và HC.
Phân tích làm giàu đường dẫn KEGG của các chất chuyển hóa khác biệt đáng kể trong nhóm LA so với nhóm BN và HC. Đã sử dụng kiểm định Globaltest hai phía và điều chỉnh giá trị p bằng phương pháp Holm-Bonferroni (p điều chỉnh ≤ 0,001 và kích thước hiệu ứng > 0,01). b–d Biểu đồ violin thể hiện nồng độ hypoxanthine, xanthine, lactate, pyruvate và tryptophan trong huyết thanh HC, BN và LA được xác định bằng LC-MS/MS (n = 70 mỗi nhóm). Các đường chấm trắng và đen lần lượt biểu thị giá trị trung vị và tứ phân vị. e Biểu đồ violin thể hiện biểu hiện mRNA Log2TPM (số bản sao trên triệu) được chuẩn hóa của SLC7A5 và QPRT trong ung thư biểu mô tuyến phổi (n = 513) so với mô phổi bình thường (n = 59) trong bộ dữ liệu LUAD-TCGA. Hình vuông màu trắng biểu thị khoảng tứ phân vị, đường kẻ ngang màu đen ở giữa biểu thị giá trị trung vị, và đường kẻ dọc màu đen kéo dài từ hình vuông biểu thị khoảng tin cậy 95% (CI). f Biểu đồ tương quan Pearson về biểu hiện SLC7A5 và GAPDH trong ung thư biểu mô tuyến phổi (n = 513) và mô phổi bình thường (n = 59) trong bộ dữ liệu TCGA. Vùng màu xám biểu thị khoảng tin cậy 95%. r, hệ số tương quan Pearson. g Mức tryptophan tế bào được chuẩn hóa trong tế bào A549 được chuyển gen với shRNA kiểm soát không đặc hiệu (NC) và shSLC7A5 (Sh1, Sh2) được xác định bằng LC-MS/MS. Phân tích thống kê của năm mẫu độc lập về mặt sinh học trong mỗi nhóm được trình bày. h Mức NADt tế bào (tổng NAD, bao gồm NAD+ và NADH) trong tế bào A549 (NC) và tế bào A549 bị ức chế SLC7A5 (Sh1, Sh2). Phân tích thống kê của ba mẫu độc lập về mặt sinh học trong mỗi nhóm được trình bày. i Hoạt động đường phân của tế bào A549 trước và sau khi ức chế SLC7A5 được đo bằng tốc độ axit hóa ngoại bào (ECAR) (n = 4 mẫu độc lập về mặt sinh học trên mỗi nhóm). 2-DG, 2-deoxy-D-glucose. Phép kiểm t Student hai phía được sử dụng trong (b–h). Trong (g–i), các thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần độc lập và kết quả tương tự nhau. Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu nguồn.
Xét đến tác động đáng kể của sự thay đổi chuyển hóa tryptophan trong nhóm LA, chúng tôi cũng đã đánh giá nồng độ tryptophan trong huyết thanh ở các nhóm HC, BN và LA bằng QQQ. Chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ tryptophan trong huyết thanh giảm ở nhóm LA so với nhóm HC hoặc BN (p < 0,001, Hình 5d), điều này phù hợp với các phát hiện trước đây cho thấy nồng độ tryptophan lưu hành thấp hơn ở bệnh nhân ung thư phổi so với nhóm đối chứng khỏe mạnh33,34,35. Một nghiên cứu khác sử dụng chất đánh dấu PET/CT 11C-methyl-L-tryptophan cho thấy thời gian lưu giữ tín hiệu tryptophan trong mô ung thư phổi tăng đáng kể so với các tổn thương lành tính hoặc mô bình thường36. Chúng tôi giả thuyết rằng sự giảm tryptophan trong huyết thanh LA có thể phản ánh sự hấp thụ tryptophan tích cực của các tế bào ung thư phổi.
Người ta cũng biết rằng sản phẩm cuối cùng của con đường kynurenine trong quá trình dị hóa tryptophan là NAD+37,38, một chất nền quan trọng cho phản ứng của glyceraldehyde-3-phosphate với 1,3-bisphosphoglycerate trong quá trình đường phân39. Trong khi các nghiên cứu trước đây tập trung vào vai trò của quá trình dị hóa tryptophan trong điều hòa miễn dịch, chúng tôi tìm cách làm sáng tỏ sự tương tác giữa rối loạn điều hòa tryptophan và các con đường đường phân được quan sát thấy trong nghiên cứu hiện tại. Thành viên 5 của họ vận chuyển chất tan 7 (SLC7A5) được biết đến là một chất vận chuyển tryptophan43,44,45. Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) là một enzyme nằm ở hạ lưu của con đường kynurenine, chuyển đổi axit quinolinic thành NAD+46. Việc kiểm tra bộ dữ liệu LUAD TCGA cho thấy cả SLC7A5 và QPRT đều được điều chỉnh tăng đáng kể trong mô khối u so với mô bình thường (Hình 5e). Sự gia tăng này được quan sát thấy ở giai đoạn I và II cũng như giai đoạn III và IV của ung thư biểu mô tuyến phổi (Hình bổ sung 11), cho thấy những rối loạn sớm trong quá trình chuyển hóa tryptophan liên quan đến sự hình thành khối u.
Ngoài ra, bộ dữ liệu LUAD-TCGA cho thấy mối tương quan tích cực giữa biểu hiện mRNA của SLC7A5 và GAPDH trong các mẫu bệnh phẩm ung thư (r = 0,45, p = 1,55E-26, Hình 5f). Ngược lại, không tìm thấy mối tương quan đáng kể nào giữa các dấu hiệu gen này trong mô phổi bình thường (r = 0,25, p = 0,06, Hình 5f). Việc ức chế SLC7A5 (Hình bổ sung 12) trong tế bào A549 làm giảm đáng kể nồng độ tryptophan và NAD(H) trong tế bào (Hình 5g,h), dẫn đến hoạt động đường phân bị suy giảm được đo bằng tốc độ axit hóa ngoại bào (ECAR) (Hình 1). 5i). Do đó, dựa trên những thay đổi chuyển hóa trong huyết thanh và phát hiện trong ống nghiệm, chúng tôi giả thuyết rằng quá trình chuyển hóa tryptophan có thể tạo ra NAD+ thông qua con đường kynurenine và đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình đường phân trong ung thư phổi.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số lượng lớn các nốt phổi không xác định được phát hiện bằng LDCT có thể dẫn đến nhu cầu xét nghiệm bổ sung như PET-CT, sinh thiết phổi và điều trị quá mức do chẩn đoán dương tính giả về bệnh ác tính.31 Như thể hiện trong Hình 6, nghiên cứu của chúng tôi đã xác định một nhóm các chất chuyển hóa trong huyết thanh có giá trị chẩn đoán tiềm năng có thể cải thiện việc phân tầng nguy cơ và quản lý tiếp theo đối với các nốt phổi được phát hiện bằng CT.
Các nốt phổi được đánh giá bằng chụp cắt lớp vi tính liều thấp (LDCT) với các đặc điểm hình ảnh gợi ý nguyên nhân lành tính hoặc ác tính. Kết quả không chắc chắn của các nốt có thể dẫn đến các lần khám theo dõi thường xuyên, các can thiệp không cần thiết và điều trị quá mức. Việc bổ sung các phân loại chuyển hóa huyết thanh có giá trị chẩn đoán có thể cải thiện việc đánh giá rủi ro và quản lý tiếp theo đối với các nốt phổi. PET (chụp cắt lớp phát xạ positron).
Dữ liệu từ nghiên cứu NLST của Mỹ và nghiên cứu NELSON của châu Âu cho thấy việc sàng lọc các nhóm có nguy cơ cao bằng chụp cắt lớp vi tính liều thấp (LDCT) có thể làm giảm tỷ lệ tử vong do ung thư phổi1,3. Tuy nhiên, việc đánh giá nguy cơ và quản lý lâm sàng tiếp theo đối với số lượng lớn các nốt phổi tình cờ được phát hiện bằng LDCT vẫn là thách thức lớn nhất. Mục tiêu chính là tối ưu hóa việc phân loại chính xác các phác đồ dựa trên LDCT hiện có bằng cách kết hợp các dấu ấn sinh học đáng tin cậy.
Một số dấu ấn sinh học phân tử nhất định, chẳng hạn như các chất chuyển hóa trong máu, đã được xác định bằng cách so sánh ung thư phổi với nhóm đối chứng khỏe mạnh15,17. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi tập trung vào việc ứng dụng phân tích chuyển hóa huyết thanh để phân biệt giữa các nốt phổi lành tính và ác tính được phát hiện tình cờ bằng LDCT. Chúng tôi đã so sánh toàn bộ hệ thống chuyển hóa huyết thanh của nhóm đối chứng khỏe mạnh (HC), các nốt phổi lành tính (BN) và các mẫu ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I (LA) bằng phân tích UPLC-HRMS. Chúng tôi nhận thấy rằng HC và BN có hồ sơ chuyển hóa tương tự nhau, trong khi LA cho thấy những thay đổi đáng kể so với HC và BN. Chúng tôi đã xác định được hai nhóm chất chuyển hóa huyết thanh giúp phân biệt LA với HC và BN.
Phương pháp xác định nốt lành tính và ác tính dựa trên LDCT hiện nay chủ yếu dựa trên kích thước, mật độ, hình thái và tốc độ tăng trưởng của nốt theo thời gian30. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng kích thước của nốt có liên quan chặt chẽ đến khả năng mắc ung thư phổi. Ngay cả ở những bệnh nhân có nguy cơ cao, nguy cơ ác tính ở các nốt <6 mm cũng dưới 1%. Nguy cơ ác tính đối với các nốt có kích thước từ 6 đến 20 mm dao động từ 8% đến 64%30. Do đó, Hiệp hội Fleischner khuyến nghị đường kính cắt là 6 mm cho việc theo dõi CT thường quy.29 Tuy nhiên, việc đánh giá rủi ro và quản lý các nốt phổi không xác định (IPN) lớn hơn 6 mm vẫn chưa được thực hiện đầy đủ31. Việc quản lý bệnh tim bẩm sinh hiện nay thường dựa trên việc theo dõi cẩn thận với việc giám sát CT thường xuyên.
Dựa trên hệ thống chuyển hóa đã được xác thực, chúng tôi lần đầu tiên chứng minh sự trùng lặp của các dấu ấn chuyển hóa giữa các cá thể khỏe mạnh và các nốt lành tính <6 mm. Sự tương đồng về mặt sinh học này phù hợp với các phát hiện CT trước đây cho thấy nguy cơ ác tính đối với các nốt <6 mm thấp tương đương với các đối tượng không có nốt.30 Cần lưu ý rằng kết quả của chúng tôi cũng cho thấy các nốt lành tính <6 mm và ≥6 mm có sự tương đồng cao về hồ sơ chuyển hóa, cho thấy định nghĩa chức năng về nguyên nhân lành tính là nhất quán bất kể kích thước nốt. Do đó, các bảng chuyển hóa huyết thanh chẩn đoán hiện đại có thể cung cấp một xét nghiệm duy nhất như một xét nghiệm loại trừ khi các nốt được phát hiện lần đầu trên CT và có khả năng giảm việc theo dõi định kỳ. Đồng thời, cùng một bảng các dấu ấn sinh học chuyển hóa đã phân biệt được các nốt ác tính có kích thước ≥6 mm với các nốt lành tính và cung cấp các dự đoán chính xác cho các IPN có kích thước tương tự và các đặc điểm hình thái không rõ ràng trên hình ảnh CT. Bộ phân loại chuyển hóa huyết thanh này hoạt động tốt trong việc dự đoán tính ác tính của các nốt ≥6 mm với AUC là 0,927. Tóm lại, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các dấu ấn chuyển hóa huyết thanh độc đáo có thể phản ánh cụ thể những thay đổi chuyển hóa do khối u gây ra ở giai đoạn sớm và có giá trị tiềm tàng như là các yếu tố dự báo nguy cơ, độc lập với kích thước khối u.
Đáng chú ý, ung thư biểu mô tuyến phổi (LUAD) và ung thư biểu mô tế bào vảy (LUSC) là hai loại ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) chính. Do LUSC có liên quan chặt chẽ với việc sử dụng thuốc lá47 và LUAD là loại mô học phổ biến nhất của các nốt phổi tình cờ được phát hiện khi sàng lọc bằng CT48, mô hình phân loại của chúng tôi được xây dựng đặc biệt cho các mẫu ung thư biểu mô tuyến giai đoạn I. Wang và các đồng nghiệp cũng tập trung vào LUAD và xác định chín dấu ấn lipid bằng phương pháp lipidomics để phân biệt ung thư phổi giai đoạn sớm với người khỏe mạnh17. Chúng tôi đã thử nghiệm mô hình phân loại hiện tại trên 16 trường hợp LUSC giai đoạn I và 74 nốt lành tính và quan sát thấy độ chính xác dự đoán LUSC thấp (AUC 0,776), cho thấy LUAD và LUSC có thể có các dấu ấn chuyển hóa riêng. Thực tế, LUAD và LUSC đã được chứng minh là khác nhau về nguyên nhân, nguồn gốc sinh học và các bất thường di truyền49. Do đó, các loại mô học khác nên được đưa vào các mô hình huấn luyện để phát hiện ung thư phổi dựa trên quần thể trong các chương trình sàng lọc.
Tại đây, chúng tôi đã xác định sáu con đường chuyển hóa bị biến đổi thường xuyên nhất ở bệnh ung thư biểu mô tuyến phổi so với nhóm đối chứng khỏe mạnh và các khối u lành tính. Xanthine và hypoxanthine là các chất chuyển hóa phổ biến của con đường chuyển hóa purine. Phù hợp với kết quả của chúng tôi, các chất trung gian liên quan đến chuyển hóa purine đã tăng lên đáng kể trong huyết thanh hoặc mô của bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi so với nhóm đối chứng khỏe mạnh hoặc bệnh nhân ở giai đoạn tiền xâm lấn15,50. Nồng độ xanthine và hypoxanthine trong huyết thanh tăng cao có thể phản ánh quá trình đồng hóa cần thiết cho các tế bào ung thư đang tăng sinh nhanh chóng. Rối loạn chuyển hóa glucose là một dấu hiệu đặc trưng nổi tiếng của chuyển hóa ung thư51. Tại đây, chúng tôi quan sát thấy sự gia tăng đáng kể pyruvate và lactate ở nhóm LA so với nhóm HC và BN, điều này phù hợp với các báo cáo trước đây về sự bất thường của con đường đường phân trong hồ sơ chuyển hóa huyết thanh của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) và nhóm đối chứng khỏe mạnh. Kết quả là nhất quán52,53.
Điều quan trọng là, chúng tôi đã quan sát thấy mối tương quan nghịch đảo giữa quá trình chuyển hóa pyruvate và tryptophan trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi. Nồng độ tryptophan trong huyết thanh giảm ở nhóm LA so với nhóm HC hoặc BN. Điều thú vị là, một nghiên cứu quy mô lớn trước đây sử dụng nhóm đối tượng nghiên cứu tiền cứu đã phát hiện ra rằng nồng độ tryptophan lưu hành thấp có liên quan đến tăng nguy cơ ung thư phổi 54. Tryptophan là một axit amin thiết yếu mà chúng ta nhận được hoàn toàn từ thực phẩm. Chúng tôi kết luận rằng sự suy giảm tryptophan trong huyết thanh ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi có thể phản ánh sự suy giảm nhanh chóng của chất chuyển hóa này. Người ta biết rằng sản phẩm cuối cùng của quá trình dị hóa tryptophan thông qua con đường kynurenine là nguồn tổng hợp NAD+ mới. Vì NAD+ được sản xuất chủ yếu thông qua con đường tái sử dụng, tầm quan trọng của NAD+ trong quá trình chuyển hóa tryptophan trong sức khỏe và bệnh tật vẫn cần được xác định 46. Phân tích dữ liệu TCGA của chúng tôi cho thấy biểu hiện của chất vận chuyển tryptophan solute transporter 7A5 (SLC7A5) tăng đáng kể ở ung thư biểu mô tuyến phổi so với nhóm đối chứng bình thường và có tương quan dương tính với biểu hiện của enzyme đường phân GAPDH. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào vai trò của quá trình dị hóa tryptophan trong việc ức chế phản ứng miễn dịch chống khối u40,41,42. Ở đây, chúng tôi chứng minh rằng việc ức chế hấp thu tryptophan bằng cách làm giảm biểu hiện SLC7A5 trong tế bào ung thư phổi dẫn đến sự giảm mức NAD trong tế bào và đồng thời làm suy giảm hoạt động đường phân. Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi cung cấp cơ sở sinh học cho những thay đổi trong chuyển hóa huyết thanh liên quan đến sự chuyển đổi ác tính của ung thư biểu mô tuyến phổi.
Đột biến EGFR là đột biến chủ đạo phổ biến nhất ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC). Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi nhận thấy rằng bệnh nhân có đột biến EGFR (n = 41) có hồ sơ chuyển hóa tổng thể tương tự như bệnh nhân có EGFR kiểu hoang dã (n = 31), mặc dù chúng tôi nhận thấy nồng độ acylcarnitine trong huyết thanh giảm ở một số bệnh nhân đột biến EGFR. Chức năng đã được xác định của acylcarnitine là vận chuyển các nhóm acyl từ tế bào chất vào chất nền ty thể, dẫn đến quá trình oxy hóa axit béo để tạo ra năng lượng 55. Phù hợp với phát hiện của chúng tôi, một nghiên cứu gần đây cũng đã xác định được hồ sơ chuyển hóa tương tự giữa các khối u đột biến EGFR và EGFR kiểu hoang dã bằng cách phân tích chuyển hóa toàn cầu của 102 mẫu mô ung thư biểu mô tuyến phổi 50. Điều thú vị là, hàm lượng acylcarnitine cũng được tìm thấy trong nhóm đột biến EGFR. Do đó, liệu những thay đổi trong mức độ acylcarnitine có phản ánh những thay đổi chuyển hóa do EGFR gây ra và các con đường phân tử cơ bản hay không cần được nghiên cứu thêm.
Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi thiết lập một bộ phân loại chuyển hóa huyết thanh để chẩn đoán phân biệt các nốt phổi và đề xuất một quy trình có thể tối ưu hóa việc đánh giá rủi ro và tạo điều kiện thuận lợi cho quản lý lâm sàng dựa trên sàng lọc bằng chụp CT.
Nghiên cứu này đã được Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện Ung thư Đại học Sun Yat-sen, Bệnh viện Đa khoa số 1 trực thuộc Đại học Sun Yat-sen và Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện Ung thư Đại học Trịnh Châu phê duyệt. Trong nhóm khám phá và nhóm thẩm định nội bộ, 174 mẫu huyết thanh từ người khỏe mạnh và 244 mẫu huyết thanh từ các khối u lành tính được thu thập từ những người tham gia khám sức khỏe định kỳ hàng năm tại Khoa Kiểm soát và Phòng ngừa Ung thư, Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen, và 166 mẫu huyết thanh từ các khối u lành tính. Các trường hợp ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I được thu thập từ Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen. Trong nhóm thẩm định bên ngoài, có 48 trường hợp khối u lành tính, 39 trường hợp ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I từ Bệnh viện Đa khoa số 1 trực thuộc Đại học Sun Yat-sen và 24 trường hợp ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I từ Bệnh viện Ung thư Trịnh Châu. Trung tâm Ung thư Đại học Tôn Trung Sơn cũng thu thập 16 trường hợp ung thư phổi tế bào vảy giai đoạn I để kiểm tra khả năng chẩn đoán của bộ phân loại chuyển hóa đã được thiết lập (đặc điểm bệnh nhân được trình bày trong Bảng bổ sung 5). Các mẫu từ nhóm nghiên cứu ban đầu và nhóm thẩm định nội bộ được thu thập từ tháng 1 năm 2018 đến tháng 5 năm 2020. Các mẫu cho nhóm thẩm định bên ngoài được thu thập từ tháng 8 năm 2021 đến tháng 10 năm 2022. Để giảm thiểu sai lệch giới tính, số lượng nam và nữ được phân bổ gần bằng nhau cho mỗi nhóm. Nhóm Nghiên cứu Ban đầu và Nhóm Đánh giá Nội bộ. Giới tính của người tham gia được xác định dựa trên báo cáo tự nguyện. Tất cả người tham gia đều đã đồng ý tham gia và không có khoản bồi thường nào được cung cấp. Các đối tượng có khối u lành tính là những người có điểm chụp CT ổn định từ 2 đến 5 năm tại thời điểm phân tích, ngoại trừ 1 trường hợp từ mẫu thẩm định bên ngoài, được thu thập trước phẫu thuật và được chẩn đoán bằng mô học. Ngoại trừ viêm phế quản mãn tính. Các trường hợp ung thư biểu mô tuyến phổi được thu thập trước khi cắt bỏ phổi và được xác nhận bằng chẩn đoán bệnh lý. Mẫu máu lúc đói được thu thập trong ống tách huyết thanh mà không có chất chống đông. Mẫu máu được để đông trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm ở 2851 × g trong 10 phút ở 4°C để thu lấy dịch nổi huyết thanh. Các phần huyết thanh được đông lạnh ở -80°C cho đến khi chiết xuất chất chuyển hóa. Khoa Phòng chống Ung thư và Khám sức khỏe của Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen đã thu thập một mẫu huyết thanh chung từ 100 người hi khỏe mạnh, bao gồm số lượng nam và nữ bằng nhau, trong độ tuổi từ 40 đến 55. Thể tích bằng nhau của mỗi mẫu máu người hiến tặng được trộn lẫn, hỗn hợp thu được được chia thành các phần nhỏ và bảo quản ở -80°C. Hỗn hợp huyết thanh này được sử dụng làm vật liệu tham khảo để kiểm soát chất lượng và chuẩn hóa dữ liệu.
Mẫu huyết thanh tham chiếu và mẫu thử nghiệm được rã đông và các chất chuyển hóa được chiết xuất bằng phương pháp chiết xuất kết hợp (MTBE/methanol/nước) 56. Tóm lại, 50 μl huyết thanh được trộn với 225 μl methanol lạnh và 750 μl methyl tert-butyl ether (MTBE) lạnh. Khuấy đều hỗn hợp và ủ trên đá trong 1 giờ. Sau đó, các mẫu được trộn đều và khuấy bằng máy khuấy vortex với 188 μl nước tinh khiết dùng cho MS có chứa các chất chuẩn nội (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine và 13C6-isoleucine, mua từ Cambridge Isotope Laboratories). Hỗn hợp sau đó được ly tâm ở 15.000 × g trong 10 phút ở 4 °C, và pha dưới được chuyển vào hai ống (mỗi ống 125 μL) để phân tích LC-MS ở chế độ dương và âm. Cuối cùng, mẫu được làm bay hơi đến khô trong một thiết bị cô đặc chân không tốc độ cao.
Các chất chuyển hóa đã được làm khô được hòa tan lại trong 120 μl acetonitrile 80%, lắc đều trong 5 phút và ly tâm ở 15.000 × g trong 10 phút ở 4°C. Phần dịch nổi được chuyển vào các lọ thủy tinh màu hổ phách có màng lọc nhỏ để nghiên cứu chuyển hóa học. Phân tích chuyển hóa học không định hướng được thực hiện trên nền tảng sắc ký lỏng hiệu năng cao - khối phổ độ phân giải cao (UPLC-HRMS). Các chất chuyển hóa được tách bằng hệ thống UPLC Dionex Ultimate 3000 và cột ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Ở chế độ ion dương, pha động gồm 95% (A) và 50% acetonitrile (B), mỗi pha chứa 10 mmol/L amoni axetat và 0,1% axit formic. Ở chế độ âm, pha động A và B lần lượt chứa 95% và 50% acetonitrile, cả hai pha đều chứa 10 mmol/L amoni axetat, pH = 9. Chương trình gradient như sau: 0–0,5 phút, 2% B; 0,5–12 phút, 2–50% B; 12–14 phút, 50–98% B; 14–16 phút, 98% B; 16–16,1 phút, 98–2% B; 16,1–20 phút, 2% B. Cột được duy trì ở 40°C và mẫu ở 10°C trong bộ lấy mẫu tự động. Tốc độ dòng chảy là 0,3 ml/phút, thể tích tiêm là 3 μl. Máy quang phổ khối Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) với nguồn ion hóa phun điện (ESI) được vận hành ở chế độ quét toàn phổ và kết hợp với chế độ giám sát ddMS2 để thu thập lượng dữ liệu lớn. Các thông số MS được thiết lập như sau: điện áp phun +3,8 kV/- 3,2 kV, nhiệt độ mao dẫn 320°C, khí bảo vệ 40 arb, khí phụ trợ 10 arb, nhiệt độ bộ gia nhiệt đầu dò 350°C, phạm vi quét 70–1050 m/h, độ phân giải 70.000. Dữ liệu được thu thập bằng phần mềm Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Để đánh giá chất lượng dữ liệu, các mẫu kiểm soát chất lượng (QC) được tạo ra bằng cách lấy 10 μL dịch nổi từ mỗi mẫu. Sáu mẫu kiểm soát chất lượng được tiêm vào và phân tích ở đầu chuỗi phân tích để đánh giá độ ổn định của hệ thống UPLC-MS. Sau đó, các mẫu kiểm soát chất lượng được đưa vào lô phân tích định kỳ. Tất cả 11 lô mẫu huyết thanh trong nghiên cứu này đều được phân tích bằng LC-MS. Các phần mẫu huyết thanh hỗn hợp từ 100 người hiến tặng khỏe mạnh được sử dụng làm vật liệu tham chiếu trong các lô tương ứng để theo dõi quá trình chiết xuất và điều chỉnh ảnh hưởng giữa các lô. Phân tích chuyển hóa không định hướng của nhóm nghiên cứu ban đầu, nhóm thẩm định nội bộ và nhóm thẩm định bên ngoài được thực hiện tại Trung tâm Chuyển hóa của Đại học Sun Yat-sen. Phòng thí nghiệm bên ngoài của Trung tâm Phân tích và Thử nghiệm thuộc Đại học Công nghệ Quảng Đông cũng đã phân tích 40 mẫu từ nhóm bên ngoài để kiểm tra hiệu suất của mô hình phân loại.
Sau khi chiết xuất và tái cấu trúc, định lượng tuyệt đối các chất chuyển hóa trong huyết thanh được đo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cực cao kết hợp với phổ khối lượng song song (Agilent 6495 triple quadrupole) với nguồn ion hóa phun điện (ESI) ở chế độ giám sát phản ứng đa điểm (MRM). Cột ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) được sử dụng để tách các chất chuyển hóa. Pha động bao gồm 90% (A) và 5% acetonitrile (B) với dung dịch amoni axetat 10 mmol/L và amoniac 0,1%. Chương trình gradient như sau: 0–1,5 phút, 0% B; 1,5–6,5 phút, 0–15% B; 6,5–8 phút, 15% B; 8–8,5 phút, 15%–0% B; 8,5–11,5 phút, 0% B. Cột sắc ký được duy trì ở 40 °C và mẫu ở 10 °C trong bộ lấy mẫu tự động. Tốc độ dòng chảy là 0,3 mL/min và thể tích tiêm là 1 μL. Các thông số MS được thiết lập như sau: điện áp mao dẫn ±3,5 kV, áp suất phun sương 35 psi, lưu lượng khí bao 12 L/min, nhiệt độ khí bao 350°C, nhiệt độ khí làm khô 250°C và lưu lượng khí làm khô 14 l/min. Độ chuyển hóa MRM của tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine và xanthine lần lượt là 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 và 151,0–107,9. Dữ liệu được thu thập bằng phần mềm Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Đối với mẫu huyết thanh, tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine và xanthine được định lượng bằng cách sử dụng đường cong hiệu chuẩn của các dung dịch hỗn hợp chuẩn. Đối với mẫu tế bào, hàm lượng tryptophan được chuẩn hóa theo chất chuẩn nội và khối lượng protein tế bào.
Việc trích xuất đỉnh (m/z và thời gian lưu giữ (RT)) được thực hiện bằng Compound Discovery 3.1 và TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Để loại bỏ sự khác biệt tiềm ẩn giữa các lô, mỗi đỉnh đặc trưng của mẫu thử được chia cho đỉnh đặc trưng của vật liệu tham chiếu từ cùng một lô để thu được độ phong phú tương đối. Độ lệch chuẩn tương đối của các chất chuẩn nội trước và sau khi chuẩn hóa được thể hiện trong Bảng bổ sung 6. Sự khác biệt giữa hai nhóm được đặc trưng bởi tỷ lệ phát hiện sai (FDR<0,05, kiểm định Wilcoxon signed rank) và thay đổi gấp (>1,2 hoặc <0,83). Dữ liệu MS thô của các đặc điểm được trích xuất và dữ liệu MS được hiệu chỉnh bằng huyết thanh tham chiếu được thể hiện trong Dữ liệu bổ sung 1 và Dữ liệu bổ sung 2, tương ứng. Việc chú thích đỉnh được thực hiện dựa trên bốn cấp độ nhận dạng được xác định, bao gồm các chất chuyển hóa được xác định, các hợp chất được chú thích giả định, các lớp hợp chất được đặc trưng giả định và các hợp chất chưa biết 22. Dựa trên các tìm kiếm cơ sở dữ liệu trong Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), các hợp chất sinh học có MS/MS khớp với các tiêu chuẩn đã được xác thực hoặc có chú thích khớp chính xác trong mzCloud (điểm > 85) hoặc Chemspider cuối cùng được chọn làm chất trung gian giữa các chuyển hóa khác biệt. Chú thích đỉnh cho mỗi đặc điểm được bao gồm trong Dữ liệu bổ sung 3. MetaboAnalyst 5.0 được sử dụng để phân tích đơn biến về tổng lượng chất chuyển hóa được chuẩn hóa. MetaboAnalyst 5.0 cũng đánh giá phân tích làm giàu đường dẫn KEGG dựa trên các chất chuyển hóa khác biệt đáng kể. Phân tích thành phần chính (PCA) và phân tích phân biệt bình phương tối thiểu từng phần (PLS-DA) được phân tích bằng gói phần mềm ropls (v.1.26.4) với chuẩn hóa xếp chồng và tự động điều chỉnh tỷ lệ. Mô hình dấu ấn sinh học chất chuyển hóa tối ưu để dự đoán tính ác tính của nốt được tạo ra bằng cách sử dụng hồi quy logistic nhị phân với toán tử co rút và lựa chọn tuyệt đối nhỏ nhất (LASSO, gói R v.4.1-3). Hiệu suất của mô hình phân biệt trong tập dữ liệu phát hiện và xác thực được đặc trưng bằng cách ước tính AUC dựa trên phân tích ROC theo gói pROC (v.1.18.0). Ngưỡng xác suất tối ưu được xác định dựa trên chỉ số Youden tối đa của mô hình (độ nhạy + độ đặc hiệu – 1). Các mẫu có giá trị nhỏ hơn hoặc lớn hơn ngưỡng sẽ được dự đoán lần lượt là nốt lành tính và ung thư biểu mô tuyến phổi.
Tế bào A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) được nuôi cấy trong môi trường F-12K chứa 10% FBS. Trình tự RNA sợi ngắn (shRNA) nhắm mục tiêu SLC7A5 và một trình tự kiểm soát không nhắm mục tiêu (NC) được chèn vào vectơ lentivirus pLKO.1-puro. Trình tự antisense của shSLC7A5 như sau: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Kháng thể chống SLC7A5 (#5347) và tubulin (#2148) được mua từ Cell Signaling Technology. Kháng thể chống SLC7A5 và tubulin được sử dụng ở độ pha loãng 1:1000 cho phân tích Western blot.
Bộ thử nghiệm Seahorse XF Glycolytic Stress Test đo mức độ axit hóa ngoại bào (ECAR). Trong thử nghiệm này, glucose, oligomycin A và 2-DG được đưa vào tuần tự để kiểm tra khả năng đường phân của tế bào được đo bằng ECAR.
Tế bào A549 được chuyển gen với plasmid kiểm soát không nhắm mục tiêu (NC) và shSLC7A5 (Sh1, Sh2) được nuôi cấy qua đêm trong đĩa đường kính 10 cm. Các chất chuyển hóa của tế bào được chiết xuất bằng 1 ml methanol 80% lạnh. Tế bào trong dung dịch methanol được cạo ra, thu thập vào một ống nghiệm mới và ly tâm ở 15.000 × g trong 15 phút ở 4°C. Thu thập 800 µl dịch nổi và làm khô bằng máy cô đặc chân không tốc độ cao. Sau đó, các cặn chất chuyển hóa đã khô được phân tích hàm lượng tryptophan bằng LC-MS/MS như mô tả ở trên. Hàm lượng NAD(H) trong tế bào A549 (NC và shSLC7A5) được đo bằng bộ kit đo màu NAD+/NADH định lượng (#K337, BioVision) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng protein được đo cho mỗi mẫu để chuẩn hóa lượng chất chuyển hóa.
Không có phương pháp thống kê nào được sử dụng để xác định sơ bộ kích thước mẫu. Các nghiên cứu chuyển hóa học trước đây nhằm mục đích phát hiện dấu ấn sinh học15,18 đã được coi là tiêu chuẩn để xác định kích thước mẫu, và so với các báo cáo này, mẫu của chúng tôi là đủ. Không có mẫu nào bị loại khỏi nhóm nghiên cứu. Các mẫu huyết thanh được phân bổ ngẫu nhiên vào nhóm khám phá (306 trường hợp, 74,6%) và nhóm thẩm định nội bộ (104 trường hợp, 25,4%) cho các nghiên cứu chuyển hóa học không định hướng. Chúng tôi cũng chọn ngẫu nhiên 70 trường hợp từ mỗi nhóm từ tập hợp khám phá cho các nghiên cứu chuyển hóa học định hướng. Các nhà nghiên cứu không biết về việc phân nhóm trong quá trình thu thập và phân tích dữ liệu LC-MS. Phân tích thống kê dữ liệu chuyển hóa học và các thí nghiệm tế bào được mô tả trong các phần Kết quả, Chú thích hình và Phương pháp tương ứng. Việc định lượng tryptophan tế bào, NADT và hoạt động đường phân được thực hiện ba lần độc lập với kết quả giống hệt nhau.
Để biết thêm thông tin về thiết kế nghiên cứu, vui lòng xem Bản tóm tắt Báo cáo Danh mục Đầu tư Tự nhiên kèm theo bài viết này.
Dữ liệu MS thô của các đặc điểm được trích xuất và dữ liệu MS chuẩn hóa của huyết thanh tham chiếu được hiển thị trong Dữ liệu bổ sung 1 và Dữ liệu bổ sung 2 tương ứng. Chú thích đỉnh cho các đặc điểm khác biệt được trình bày trong Dữ liệu bổ sung 3. Bộ dữ liệu LUAD TCGA có thể được tải xuống từ https://portal.gdc.cancer.gov/. Dữ liệu đầu vào để vẽ đồ thị được cung cấp trong dữ liệu nguồn. Dữ liệu nguồn được cung cấp cho bài báo này.
Nhóm nghiên cứu sàng lọc phổi quốc gia, v.v. Giảm tỷ lệ tử vong do ung thư phổi bằng chụp cắt lớp vi tính liều thấp. Bắc Anh. Tạp chí Y học. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR và Prophet, PC. Sàng lọc ung thư phổi bằng chụp CT xoắn ốc liều thấp: kết quả từ Nghiên cứu Sàng lọc Phổi Quốc gia (NLST). Tạp chí Sàng lọc Y khoa 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Giảm tỷ lệ tử vong do ung thư phổi bằng phương pháp sàng lọc CT thể tích trong một thử nghiệm ngẫu nhiên. Bắc Anh. Tạp chí Y học. 382, 503–513 (2020).
Thời gian đăng bài: 18/09/2023