Chẩn đoán phân biệt các nốt phổi được xác định bằng chụp cắt lớp vi tính (CT) vẫn là một thách thức trong thực hành lâm sàng.Ở đây, chúng tôi mô tả đặc điểm chuyển hóa toàn cầu của 480 mẫu huyết thanh, bao gồm các đối chứng khỏe mạnh, các nốt phổi lành tính và ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I.Ung thư biểu mô tuyến biểu hiện các cấu hình chuyển hóa độc đáo, trong khi các nốt lành tính và cá thể khỏe mạnh có sự tương đồng cao về cấu hình chuyển hóa.Trong nhóm phát hiện (n = 306), một bộ gồm 27 chất chuyển hóa đã được xác định để phân biệt giữa các nốt lành tính và ác tính.AUC của mô hình phân biệt trong nhóm xác thực nội bộ (n = 104) và nhóm xác thực bên ngoài (n = 111) lần lượt là 0,915 và 0,945.Phân tích con đường cho thấy các chất chuyển hóa glycolytic tăng lên liên quan đến giảm tryptophan trong huyết thanh ung thư biểu mô tuyến phổi so với các nốt lành tính và các đối chứng khỏe mạnh, đồng thời cho rằng sự hấp thu tryptophan thúc đẩy quá trình glycolysis trong tế bào ung thư phổi.Nghiên cứu của chúng tôi nhấn mạnh giá trị của dấu ấn sinh học chất chuyển hóa trong huyết thanh trong việc đánh giá nguy cơ các nốt phổi được phát hiện bởi CT.
Chẩn đoán sớm là rất quan trọng để cải thiện tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân ung thư.Kết quả từ Thử nghiệm sàng lọc ung thư phổi quốc gia Hoa Kỳ (NLST) và Nghiên cứu NELSON của Châu Âu đã chỉ ra rằng sàng lọc bằng chụp cắt lớp vi tính liều thấp (LDCT) có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do ung thư phổi ở các nhóm có nguy cơ cao1,2,3.Kể từ khi sử dụng rộng rãi LDCT để sàng lọc ung thư phổi, tỷ lệ phát hiện ngẫu nhiên các nốt phổi không có triệu chứng trên X quang đã tiếp tục gia tăng.Các nốt phổi được định nghĩa là các đám mờ khu trú có đường kính lên tới 3 cm5.Chúng tôi gặp khó khăn trong việc đánh giá khả năng ác tính và xử lý số lượng lớn các nốt phổi được phát hiện tình cờ trên LDCT.Những hạn chế của CT có thể dẫn đến việc phải khám theo dõi thường xuyên và cho kết quả dương tính giả, dẫn đến can thiệp và điều trị quá mức không cần thiết6.Do đó, cần phải phát triển các dấu ấn sinh học đáng tin cậy và hữu ích để xác định chính xác ung thư phổi ở giai đoạn đầu và phân biệt hầu hết các nốt lành tính khi phát hiện ban đầu7.
Phân tích toàn diện phân tử máu (huyết thanh, huyết tương, tế bào đơn nhân máu ngoại vi), bao gồm genomics, proteomics hoặc methyl hóa DNA8,9,10, đã dẫn đến mối quan tâm ngày càng tăng trong việc phát hiện ra dấu ấn sinh học chẩn đoán ung thư phổi.Trong khi đó, các phương pháp chuyển hóa đo lường các sản phẩm cuối cùng của tế bào bị ảnh hưởng bởi các hoạt động nội sinh và ngoại sinh và do đó được áp dụng để dự đoán sự khởi phát và kết quả của bệnh.Phương pháp sắc ký lỏng-song song khối phổ (LC-MS) là phương pháp được sử dụng rộng rãi cho nghiên cứu chuyển hóa do độ nhạy cao và dải động lớn, có thể bao gồm các chất chuyển hóa có đặc tính hóa lý khác nhau11,12,13.Mặc dù phân tích chuyển hóa toàn cầu của huyết tương/huyết thanh đã được sử dụng để xác định các dấu hiệu sinh học liên quan đến chẩn đoán ung thư phổi14,15,16,17 và hiệu quả điều trị,18 phân loại chất chuyển hóa huyết thanh để phân biệt giữa các nốt phổi lành tính và ác tính vẫn còn được nghiên cứu nhiều.-nghiên cứu quy mô lớn.
Ung thư biểu mô tuyến và ung thư biểu mô tế bào vảy là hai loại chính của ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC).Các xét nghiệm sàng lọc CT khác nhau chỉ ra rằng ung thư biểu mô tuyến là loại ung thư phổi mô học phổ biến nhất1,19,20,21.Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu phân giải khối phổ có độ phân giải cao (UPLC-HRMS) để thực hiện phân tích chất chuyển hóa trên tổng số 695 mẫu huyết thanh, bao gồm các mẫu đối chứng khỏe mạnh, các nốt phổi lành tính và 3 cm được phát hiện trên CT.Sàng lọc ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I.Chúng tôi đã xác định được một nhóm các chất chuyển hóa trong huyết thanh giúp phân biệt ung thư biểu mô tuyến phổi với các nốt lành tính và các đối chứng khỏe mạnh.Phân tích làm giàu con đường cho thấy chuyển hóa tryptophan và glucose bất thường là những thay đổi phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến phổi so với các nốt lành tính và các đối chứng khỏe mạnh.Cuối cùng, chúng tôi đã thiết lập và xác nhận một bộ phân loại chuyển hóa huyết thanh có độ đặc hiệu và độ nhạy cao để phân biệt giữa các nốt phổi ác tính và lành tính được phát hiện bởi LDCT, có thể hỗ trợ chẩn đoán phân biệt sớm và đánh giá rủi ro.
Trong nghiên cứu hiện tại, các mẫu huyết thanh phù hợp với giới tính và độ tuổi được thu thập hồi cứu từ 174 đối chứng khỏe mạnh, 292 bệnh nhân có nốt phổi lành tính và 229 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I.Đặc điểm nhân khẩu học của 695 đối tượng được thể hiện trong Bảng bổ sung 1.
Như được hiển thị trong Hình 1a, tổng cộng 480 mẫu huyết thanh, bao gồm 174 mẫu đối chứng khỏe mạnh (HC), 170 nốt lành tính (BN) và 136 mẫu ung thư biểu mô tuyến phổi (LA) giai đoạn I, đã được thu thập tại Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen.Đoàn hệ khám phá để lập hồ sơ chuyển hóa không có mục tiêu bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cực cao-khối phổ có độ phân giải cao (UPLC-HRMS).Như được hiển thị trong Hình 1 bổ sung, các chất chuyển hóa khác biệt giữa LA và HC, LA và BN đã được xác định để thiết lập mô hình phân loại và khám phá thêm về phân tích con đường khác biệt.104 mẫu được thu thập bởi Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen và 111 mẫu được thu thập bởi hai bệnh viện khác lần lượt được xác nhận nội bộ và bên ngoài.
một nhóm nghiên cứu trong đoàn hệ khám phá đã trải qua phân tích chuyển hóa huyết thanh toàn cầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cực cao-khối phổ có độ phân giải cao (UPLC-HRMS).b Phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhất một phần (PLS-DA) của tổng chất chuyển hóa của 480 mẫu huyết thanh từ đoàn hệ nghiên cứu, bao gồm các đối chứng khỏe mạnh (HC, n = 174), các nốt lành tính (BN, n = 170) và ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I (Los Angeles, n = 136).+ESI, chế độ ion hóa phun điện dương, -ESI, chế độ ion hóa phun điện âm.c–e Các chất chuyển hóa có mức độ phong phú khác nhau đáng kể trong hai nhóm nhất định (kiểm tra xếp hạng có chữ ký Wilcoxon hai đuôi, giá trị p được điều chỉnh tỷ lệ phát hiện sai, FDR <0,05) được hiển thị bằng màu đỏ (thay đổi lần > 1,2) và màu xanh lam (thay đổi lần <0,83) .) được hiển thị trên đồ họa núi lửa.f Bản đồ nhiệt phân cụm theo cấp bậc cho thấy sự khác biệt đáng kể về số lượng chất chuyển hóa được chú thích giữa LA và BN.Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu nguồn.
Tổng chất chuyển hóa trong huyết thanh của 174 HC, 170 BN và 136 LA trong nhóm khám phá được phân tích bằng phân tích UPLC-HRMS.Trước tiên, chúng tôi chỉ ra rằng các mẫu kiểm soát chất lượng (QC) tập trung chặt chẽ ở trung tâm của mô hình phân tích thành phần chính không được giám sát (PCA), xác nhận tính ổn định của hiệu suất của nghiên cứu hiện tại (Hình bổ sung 2).
Như được thể hiện trong phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhất một phần (PLS-DA) trong Hình 1 b, chúng tôi thấy rằng có sự khác biệt rõ ràng giữa LA và BN, LA và HC ở chế độ ion hóa phun điện dương (+ESI) và âm (-ESI) .bị cô lập.Tuy nhiên, không tìm thấy sự khác biệt đáng kể giữa BN và HC trong điều kiện +ESI và -ESI.
Chúng tôi đã tìm thấy 382 đặc điểm khác biệt giữa LA và HC, 231 đặc điểm khác biệt giữa LA và BN và 95 đặc điểm khác biệt giữa BN và HC (kiểm tra xếp hạng có chữ ký Wilcoxon, FDR <0,05 và nhiều thay đổi >1,2 hoặc <0,83) (Hình .1c-e )..Các đỉnh được chú thích thêm (Dữ liệu bổ sung 3) dựa trên cơ sở dữ liệu (thư viện mzCloud/HMDB/Chemspider) theo giá trị m/z, thời gian lưu và tìm kiếm phổ khối phân mảnh (chi tiết được mô tả trong phần Phương pháp) 22.Cuối cùng, 33 và 38 chất chuyển hóa được chú thích với sự khác biệt đáng kể về độ phong phú đã được xác định lần lượt cho LA so với BN (Hình 1f và Bảng bổ sung 2) và LA so với HC (Hình bổ sung 3 và Bảng bổ sung 2).Ngược lại, chỉ có 3 chất chuyển hóa có sự khác biệt đáng kể về độ phong phú được xác định ở BN và HC (Bảng bổ sung 2), phù hợp với sự chồng chéo giữa BN và HC trong PLS-DA.Các chất chuyển hóa khác biệt này bao gồm một loạt các chất sinh hóa (Hình bổ sung 4).Kết hợp lại với nhau, những kết quả này chứng minh những thay đổi đáng kể trong hệ thống chuyển hóa huyết thanh phản ánh sự biến đổi ác tính của ung thư phổi giai đoạn đầu so với các nốt phổi lành tính hoặc các đối tượng khỏe mạnh.Trong khi đó, sự giống nhau về hệ chuyển hóa huyết thanh của BN và HC cho thấy các nốt phổi lành tính có thể có nhiều đặc điểm sinh học giống với người khỏe mạnh.Cho rằng đột biến gen thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) là phổ biến ở phân nhóm ung thư biểu mô tuyến phổi loại 23, chúng tôi đã tìm cách xác định tác động của đột biến trình điều khiển lên hệ chuyển hóa huyết thanh.Sau đó, chúng tôi đã phân tích hồ sơ chuyển hóa tổng thể của 72 trường hợp có tình trạng EGFR trong nhóm ung thư biểu mô tuyến phổi.Thật thú vị, chúng tôi đã tìm thấy hồ sơ có thể so sánh giữa bệnh nhân đột biến EGFR (n = 41) và bệnh nhân hoang dã EGFR (n = 31) trong phân tích PCA (Hình bổ sung 5a).Tuy nhiên, chúng tôi đã xác định được 7 chất chuyển hóa có độ phong phú thay đổi đáng kể ở những bệnh nhân bị đột biến EGFR so với những bệnh nhân có EGFR kiểu hoang dã (thử nghiệm t, p < 0,05 và thay đổi lần > 1,2 hoặc < 0,83) (Hình bổ sung 5b).Phần lớn các chất chuyển hóa này (5 trên 7) là acylcarnitine, đóng vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa axit béo.
Như được minh họa trong quy trình làm việc được hiển thị trong Hình 2 a, các dấu ấn sinh học để phân loại nốt sần đã thu được bằng cách sử dụng toán tử độ co rút tuyệt đối tối thiểu và lựa chọn dựa trên 33 chất chuyển hóa khác biệt được xác định ở LA (n = 136) và BN (n = 170).Sự kết hợp tốt nhất của các biến (LASSO) - mô hình hồi quy logistic nhị phân.Xác thực chéo mười lần đã được sử dụng để kiểm tra độ tin cậy của mô hình.Lựa chọn biến và chính quy hóa tham số được điều chỉnh bằng hình phạt tối đa hóa khả năng với tham số λ24.Phân tích chất chuyển hóa toàn cầu tiếp tục được thực hiện độc lập trong các nhóm xác thực nội bộ (n = 104) và xác thực bên ngoài (n = 111) để kiểm tra hiệu suất phân loại của mô hình phân biệt đối xử.Kết quả là, 27 chất chuyển hóa trong bộ khám phá được xác định là mô hình phân biệt tốt nhất với giá trị AUC trung bình lớn nhất (Hình 2b), trong đó 9 chất có hoạt động tăng lên và 18 chất chuyển hóa giảm hoạt động ở LA so với BN (Hình 2c).
Quy trình xây dựng bộ phân loại nốt phổi, bao gồm chọn bảng chất chuyển hóa huyết thanh tốt nhất trong bộ khám phá bằng mô hình hồi quy logistic nhị phân thông qua xác thực chéo mười lần và đánh giá hiệu suất dự đoán trong các bộ xác thực bên trong và bên ngoài.b Thống kê xác thực chéo mô hình hồi quy LASSO để lựa chọn dấu ấn sinh học trao đổi chất.Các con số nêu trên biểu thị số lượng dấu ấn sinh học trung bình được chọn ở mức λ nhất định.Đường chấm màu đỏ biểu thị giá trị AUC trung bình tại lambda tương ứng.Thanh lỗi màu xám biểu thị giá trị AUC tối thiểu và tối đa.Đường chấm chấm biểu thị mô hình tốt nhất với 27 dấu ấn sinh học được chọn.AUC, diện tích dưới đường cong đặc tính vận hành máy thu (ROC).c Gấp những thay đổi của 27 chất chuyển hóa được chọn trong nhóm LA so với nhóm BN trong nhóm khám phá.Cột màu đỏ - kích hoạt.Cột màu xanh là sự suy giảm.d – f Các đường cong đặc tính vận hành máy thu (ROC) cho thấy sức mạnh của mô hình phân biệt đối xử dựa trên 27 kết hợp chất chuyển hóa trong các bộ khám phá, xác nhận nội bộ và bên ngoài.Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu nguồn.
Một mô hình dự đoán đã được tạo ra dựa trên hệ số hồi quy có trọng số của 27 chất chuyển hóa này (Bảng bổ sung 3).Phân tích ROC dựa trên 27 chất chuyển hóa này mang lại giá trị diện tích dưới đường cong (AUC) là 0,933, độ nhạy của nhóm khám phá là 0,868 và độ đặc hiệu là 0,859 (Hình 2d).Trong khi đó, trong số 38 chất chuyển hóa khác biệt được chú thích giữa LA và HC, một bộ gồm 16 chất chuyển hóa đạt được AUC là 0,902 với độ nhạy 0,801 và độ đặc hiệu 0,856 trong việc phân biệt LA với HC (Hình bổ sung 6a-c).Các giá trị AUC dựa trên các ngưỡng thay đổi nếp gấp khác nhau đối với các chất chuyển hóa khác biệt cũng được so sánh.Chúng tôi thấy rằng mô hình phân loại hoạt động tốt nhất trong việc phân biệt LA và BN (HC) khi mức thay đổi lần được đặt thành 1,2 so với 1,5 hoặc 2,0 (Hình bổ sung 7a, b).Mô hình phân loại, dựa trên 27 nhóm chất chuyển hóa, đã được xác nhận thêm trong các đoàn hệ bên trong và bên ngoài.AUC là 0,915 (độ nhạy 0,867, độ đặc hiệu 0,811) để xác thực bên trong và 0,945 (độ nhạy 0,810, độ đặc hiệu 0,979) để xác thực bên ngoài (Hình 2e, f).Để đánh giá hiệu quả liên phòng thí nghiệm, 40 mẫu từ đoàn hệ bên ngoài đã được phân tích trong phòng thí nghiệm bên ngoài như được mô tả trong phần Phương pháp.Độ chính xác phân loại đạt AUC là 0,925 (Hình bổ sung 8).Vì ung thư biểu mô tế bào vảy ở phổi (LUSC) là loại phụ phổ biến thứ hai của ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) sau ung thư biểu mô tuyến phổi (LUAD), nên chúng tôi cũng đã thử nghiệm tính hữu ích tiềm năng đã được xác nhận của hồ sơ chuyển hóa.BN và 16 trường hợp LUSC.AUC phân biệt giữa LUSC và BN là 0, 776 (Hình bổ sung 9), cho thấy khả năng phân biệt giữa LUAD và BN kém hơn.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng kích thước của các nốt trên hình ảnh CT có mối tương quan thuận với khả năng ác tính và vẫn là yếu tố chính quyết định việc điều trị các nốt này25,26,27.Phân tích dữ liệu từ nhóm thuần tập lớn của nghiên cứu sàng lọc NELSON cho thấy nguy cơ ác tính ở những đối tượng có hạch <5 mm thậm chí còn tương tự như ở những đối tượng không có hạch 28 .Do đó, kích thước tối thiểu cần theo dõi CT thường xuyên là 5 mm, theo khuyến nghị của Hiệp hội Lồng ngực Anh (BTS) và 6 mm, theo khuyến nghị của Hiệp hội Fleischner29.Tuy nhiên, các nốt lớn hơn 6 mm và không có đặc điểm lành tính rõ ràng, được gọi là nốt phổi không xác định (IPN), vẫn là một thách thức lớn trong việc đánh giá và quản lý trong thực hành lâm sàng30,31.Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra xem kích thước nốt sần có ảnh hưởng đến dấu hiệu chuyển hóa hay không bằng cách sử dụng các mẫu gộp từ nhóm khám phá và xác nhận nội bộ.Tập trung vào 27 dấu ấn sinh học đã được xác nhận, trước tiên chúng tôi so sánh cấu hình PCA của các chất chuyển hóa HC và BN dưới 6 mm.Chúng tôi thấy rằng hầu hết các điểm dữ liệu về HC và BN trùng nhau, chứng tỏ rằng mức độ chuyển hóa trong huyết thanh là tương tự nhau ở cả hai nhóm (Hình 3a).Các bản đồ đặc điểm trên các phạm vi kích thước khác nhau vẫn được bảo tồn ở BN và LA (Hình 3b, c), trong khi đó có sự phân tách giữa các nốt ác tính và lành tính trong phạm vi 6–20 mm (Hình 3d).Đoàn hệ này có AUC là 0,927, độ đặc hiệu là 0,868 và độ nhạy là 0,820 để dự đoán mức độ ác tính của các nốt có kích thước từ 6 đến 20 mm (Hình 3e, f).Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng bộ phân loại có thể nắm bắt được những thay đổi về trao đổi chất do biến đổi ác tính sớm gây ra, bất kể kích thước nốt sần.
quảng cáo So sánh cấu hình PCA giữa các nhóm được chỉ định dựa trên phân loại trao đổi chất của 27 chất chuyển hóa.CC và BN < 6 mm.b BN < 6 mm so với BN 6–20 mm.ở LA 6–20 mm so với LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm và LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Đường cong đặc tính vận hành máy thu (ROC) hiển thị hiệu suất mô hình phân biệt đối với các nốt 6–20 mm.f Các giá trị xác suất được tính toán dựa trên mô hình hồi quy logistic cho các nốt có kích thước 6–20 mm.Đường chấm màu xám biểu thị giá trị ngưỡng tối ưu (0,455).Những con số trên thể hiện tỷ lệ phần trăm số ca dự kiến ở Los Angeles.Sử dụng bài kiểm tra t của Học sinh hai đuôi.PCA, phân tích thành phần chính.Diện tích AUC dưới đường congDữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu nguồn.
Bốn mẫu (44–61 tuổi) có kích thước nốt phổi tương tự (7–9 mm) đã được chọn thêm để minh họa hiệu suất của mô hình dự đoán bệnh ác tính được đề xuất (Hình 4a, b).Trong lần sàng lọc ban đầu, Trường hợp 1 biểu hiện dưới dạng một nốt rắn có vôi hóa, một đặc điểm liên quan đến tính lành tính, trong khi Trường hợp 2 biểu hiện dưới dạng nốt rắn một phần không xác định và không có đặc điểm lành tính rõ ràng.Ba đợt chụp CT theo dõi cho thấy những trường hợp này vẫn ổn định trong khoảng thời gian 4 năm và do đó được coi là các nốt lành tính (Hình 4a).So với đánh giá lâm sàng của chụp CT nối tiếp, phân tích chất chuyển hóa trong huyết thanh một lần với mô hình phân loại hiện tại đã xác định nhanh chóng và chính xác các nốt lành tính này dựa trên các hạn chế về xác suất (Bảng 1).Hình 4b trong trường hợp 3 cho thấy một nốt có dấu hiệu co rút màng phổi, thường liên quan đến bệnh ác tính32.Trường hợp 4 được trình bày dưới dạng một nốt cứng một phần không xác định được và không có bằng chứng về nguyên nhân lành tính.Tất cả những trường hợp này được dự đoán là ác tính theo mô hình phân loại (Bảng 1).Việc đánh giá ung thư biểu mô tuyến phổi được chứng minh bằng kiểm tra mô bệnh học sau phẫu thuật cắt bỏ phổi (Hình 4b).Đối với bộ xác nhận bên ngoài, bộ phân loại trao đổi chất dự đoán chính xác hai trường hợp nốt phổi không xác định lớn hơn 6 mm (Hình bổ sung 10).
Hình ảnh CT cửa sổ trục phổi của hai trường hợp nốt lành tính.Ở trường hợp 1, CT scan sau 4 năm cho thấy một khối u đặc ổn định kích thước 7 mm có vôi hóa ở thùy dưới bên phải.Trong trường hợp 2, CT scan sau 5 năm cho thấy một khối u ổn định, một phần đặc có đường kính 7 mm ở thùy trên bên phải.b Hình ảnh CT cửa sổ trục của phổi và nghiên cứu bệnh lý tương ứng của hai trường hợp ung thư biểu mô tuyến giai đoạn I trước khi cắt bỏ phổi.Trường hợp 3 phát hiện một nốt có đường kính 8 mm ở thùy trên bên phải kèm theo hiện tượng co rút màng phổi.Trường hợp 4 cho thấy một nốt thủy tinh mài đặc một phần có kích thước 9 mm ở thùy trên bên trái.Nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) của mô phổi được cắt bỏ (thanh tỷ lệ = 50 μm) chứng minh mô hình phát triển acinar của ung thư biểu mô tuyến phổi.Mũi tên chỉ các nốt được phát hiện trên hình ảnh CT.Hình ảnh H&E là hình ảnh đại diện của nhiều (>3) trường vi mô được nhà nghiên cứu bệnh học kiểm tra.
Kết hợp lại với nhau, kết quả của chúng tôi chứng minh giá trị tiềm năng của các dấu ấn sinh học chuyển hóa trong huyết thanh trong chẩn đoán phân biệt các nốt phổi, điều này có thể đặt ra những thách thức khi đánh giá sàng lọc CT.
Dựa trên bảng chất chuyển hóa khác biệt đã được xác nhận, chúng tôi đã tìm cách xác định mối tương quan sinh học của những thay đổi trao đổi chất chính.Phân tích làm giàu con đường KEGG của MetaboAnalyst đã xác định 6 con đường phổ biến được thay đổi đáng kể giữa hai nhóm nhất định (LA so với HC và LA so với BN, p 0,001 được điều chỉnh, hiệu ứng > 0,01).Những thay đổi này được đặc trưng bởi sự rối loạn trong chuyển hóa pyruvate, chuyển hóa tryptophan, chuyển hóa niacin và nicotinamide, quá trình đường phân, chu trình TCA và chuyển hóa purine (Hình 5a).Sau đó, chúng tôi tiếp tục thực hiện các quá trình chuyển hóa có mục tiêu để xác minh những thay đổi lớn bằng cách sử dụng định lượng tuyệt đối.Xác định các chất chuyển hóa phổ biến theo các con đường thường bị thay đổi bằng phép đo khối phổ ba cực (QQQ) sử dụng các chất chuẩn chất chuyển hóa đích thực.Các đặc điểm nhân khẩu học của mẫu mục tiêu nghiên cứu chất chuyển hóa được bao gồm trong Bảng bổ sung 4. Phù hợp với kết quả chuyển hóa toàn cầu của chúng tôi, phân tích định lượng đã xác nhận rằng hypoxanthine và xanthine, pyruvate và lactate đã tăng ở LA so với BN và HC (Hình 5b, c, p<0,05).Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể về các chất chuyển hóa này giữa BN và HC.
Phân tích làm giàu con đường KEGG của các chất chuyển hóa khác nhau đáng kể trong nhóm LA so với nhóm BN và HC.Globaltest hai đuôi đã được sử dụng và giá trị p được điều chỉnh bằng phương pháp Holm-Bonferroni (p được điều chỉnh 0,001 và kích thước hiệu ứng > 0,01).b - d Các sơ đồ violin cho thấy nồng độ hypoxanthine, xanthine, lactate, pyruvate và tryptophan trong huyết thanh HC, BN và LA được xác định bởi LC-MS/MS (n = 70 mỗi nhóm).Các đường chấm màu trắng và đen tương ứng biểu thị trung vị và tứ phân vị.e Biểu đồ violin hiển thị biểu hiện mRNA Log2TPM (bản phiên mã trên một triệu) bình thường của SLC7A5 và QPRT trong ung thư biểu mô tuyến phổi (n = 513) so với mô phổi bình thường (n = 59) trong bộ dữ liệu LUAD-TCGA.Hộp màu trắng biểu thị phạm vi liên vùng, đường màu đen nằm ngang ở giữa biểu thị điểm trung vị và đường màu đen dọc kéo dài từ hộp biểu thị khoảng tin cậy (CI) 95%.f Biểu đồ tương quan Pearson của biểu hiện SLC7A5 và GAPDH trong ung thư biểu mô tuyến phổi (n = 513) và mô phổi bình thường (n = 59) trong bộ dữ liệu TCGA.Vùng màu xám đại diện cho CI 95%.r, hệ số tương quan Pearson.g Mức tryptophan tế bào được chuẩn hóa trong các tế bào A549 được thay thế bằng điều khiển shRNA không đặc hiệu (NC) và shSLC7A5 (Sh1, Sh2) được xác định bởi LC-MS/MS.Phân tích thống kê của năm mẫu độc lập về mặt sinh học trong mỗi nhóm được trình bày.h Mức độ tế bào của NADt (tổng NAD, bao gồm NAD + và NADH) trong các ô A549 (NC) và SLC7A5 đánh bại các ô A549 (Sh1, Sh2).Phân tích thống kê của ba mẫu độc lập về mặt sinh học trong mỗi nhóm được trình bày.Hoạt động glycolytic của các tế bào A549 trước và sau khi phân hủy SLC7A5 được đo bằng tốc độ axit hóa ngoại bào (ECAR) (n = 4 mẫu độc lập về mặt sinh học trong mỗi nhóm).2-DG,2-deoxy-D-glucose.Bài kiểm tra t của Học sinh hai đuôi đã được sử dụng trong (b–h).Trong (g–i), các thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± SD, mỗi thử nghiệm được thực hiện độc lập ba lần và kết quả tương tự nhau.Dữ liệu nguồn được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu nguồn.
Xem xét tác động đáng kể của quá trình chuyển hóa tryptophan bị thay đổi ở nhóm LA, chúng tôi cũng đánh giá nồng độ tryptophan huyết thanh ở nhóm HC, BN và LA bằng QQQ.Chúng tôi thấy rằng tryptophan huyết thanh đã giảm ở LA so với HC hoặc BN (p < 0,001, Hình 5d), điều này phù hợp với những phát hiện trước đó cho thấy mức độ tryptophan lưu hành ở bệnh nhân ung thư phổi thấp hơn so với nhóm đối chứng khỏe mạnh từ nhóm đối chứng33,34 ,35.Một nghiên cứu khác sử dụng chất đánh dấu PET/CT 11C-methyl-L-tryptophan cho thấy thời gian lưu giữ tín hiệu tryptophan trong mô ung thư phổi tăng lên đáng kể so với các tổn thương lành tính hoặc mô bình thường36.Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng việc giảm tryptophan trong huyết thanh LA có thể phản ánh sự hấp thu tryptophan tích cực của các tế bào ung thư phổi.
Người ta cũng biết rằng sản phẩm cuối cùng của con đường kynurenine trong quá trình dị hóa tryptophan là NAD+37,38, đây là chất nền quan trọng cho phản ứng của glyceraldehyd-3-phosphate với 1,3-bisphosphoglycerate trong quá trình đường phân39.Trong khi các nghiên cứu trước đây tập trung vào vai trò của quá trình dị hóa tryptophan trong điều hòa miễn dịch, chúng tôi đã tìm cách làm sáng tỏ mối tương tác giữa rối loạn điều hòa tryptophan và con đường glycolytic được quan sát trong nghiên cứu hiện tại.Nhóm vận chuyển chất tan 7 thành viên 5 (SLC7A5) được biết đến là chất vận chuyển tryptophan43,44,45.Axit quinolinic photphoribosyltransferase (QPRT) là một enzyme nằm ở hạ lưu của con đường kynurenine có tác dụng chuyển axit quinolinic thành NAMN46.Việc kiểm tra bộ dữ liệu LUAD TCGA cho thấy cả SLC7A5 và QPRT đều được điều hòa đáng kể trong mô khối u so với mô bình thường (Hình 5e).Sự gia tăng này được quan sát thấy ở giai đoạn I và II cũng như giai đoạn III và IV của ung thư biểu mô tuyến phổi (Bổ sung Hình 11), cho thấy những rối loạn sớm trong chuyển hóa tryptophan liên quan đến nguyên nhân khối u.
Ngoài ra, bộ dữ liệu LUAD-TCGA cho thấy mối tương quan tích cực giữa biểu hiện mRNA SLC7A5 và GAPDH trong các mẫu bệnh nhân ung thư (r = 0,45, p = 1,55E-26, Hình 5f).Ngược lại, không tìm thấy mối tương quan đáng kể giữa các dấu hiệu gen như vậy trong mô phổi bình thường (r = 0,25, p = 0,06, Hình 5f).Việc loại bỏ SLC7A5 (Hình bổ sung 12) trong các tế bào A549 làm giảm đáng kể nồng độ tryptophan và NAD(H) của tế bào (Hình 5g, h), dẫn đến hoạt động glycolytic suy yếu được đo bằng tốc độ axit hóa ngoại bào (ECAR) (Hình 1).5i).Do đó, dựa trên những thay đổi trao đổi chất trong phát hiện huyết thanh và in vitro, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng quá trình chuyển hóa tryptophan có thể tạo ra NAD + thông qua con đường kynurenine và đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình glycolysis trong ung thư phổi.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số lượng lớn các nốt phổi không xác định được phát hiện bởi LDCT có thể dẫn đến nhu cầu xét nghiệm bổ sung như PET-CT, sinh thiết phổi và điều trị quá mức do chẩn đoán ác tính dương tính giả.31 Như được hiển thị trong Hình 6, nghiên cứu của chúng tôi đã xác định được một nhóm các chất chuyển hóa trong huyết thanh có giá trị chẩn đoán tiềm năng có thể cải thiện việc phân tầng nguy cơ và quản lý tiếp theo các nốt phổi được phát hiện bởi CT.
Các nốt phổi được đánh giá bằng chụp cắt lớp vi tính liều thấp (LDCT) với các đặc điểm hình ảnh gợi ý nguyên nhân lành tính hoặc ác tính.Kết quả không chắc chắn của các nốt sần có thể dẫn đến việc phải tái khám thường xuyên, can thiệp không cần thiết và điều trị quá mức.Việc đưa vào các phân loại chuyển hóa trong huyết thanh có giá trị chẩn đoán có thể cải thiện việc đánh giá rủi ro và quản lý các nốt phổi sau đó.Chụp cắt lớp phát xạ positron PET.
Dữ liệu từ nghiên cứu NLST của Hoa Kỳ và nghiên cứu NELSON của Châu Âu cho thấy rằng sàng lọc các nhóm có nguy cơ cao bằng chụp cắt lớp vi tính liều thấp (LDCT) có thể làm giảm tỷ lệ tử vong do ung thư phổi1,3.Tuy nhiên, việc đánh giá rủi ro và quản lý lâm sàng sau đó đối với số lượng lớn các nốt phổi ngẫu nhiên được LDCT phát hiện vẫn là thách thức lớn nhất.Mục tiêu chính là tối ưu hóa việc phân loại chính xác các giao thức dựa trên LDCT hiện có bằng cách kết hợp các dấu ấn sinh học đáng tin cậy.
Một số dấu ấn sinh học phân tử, chẳng hạn như chất chuyển hóa trong máu, đã được xác định bằng cách so sánh ung thư phổi với các đối chứng khỏe mạnh15,17.Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi tập trung vào việc áp dụng phân tích chuyển hóa huyết thanh để phân biệt giữa các nốt phổi lành tính và ác tính được LDCT phát hiện tình cờ.Chúng tôi đã so sánh hệ thống chuyển hóa huyết thanh toàn cầu của mẫu đối chứng khỏe mạnh (HC), nốt phổi lành tính (BN) và mẫu ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I (LA) bằng phân tích UPLC-HRMS.Chúng tôi thấy rằng HC và BN có cấu hình trao đổi chất tương tự nhau, trong khi LA cho thấy những thay đổi đáng kể so với HC và BN.Chúng tôi đã xác định được hai bộ chất chuyển hóa trong huyết thanh giúp phân biệt LA với HC và BN.
Sơ đồ nhận dạng dựa trên LDCT hiện nay đối với các nốt lành tính và ác tính chủ yếu dựa trên kích thước, mật độ, hình thái và tốc độ phát triển của các nốt theo thời gian30.Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng kích thước của các nốt sần có liên quan chặt chẽ đến khả năng mắc bệnh ung thư phổi.Ngay cả ở những bệnh nhân có nguy cơ cao, nguy cơ ác tính ở các hạch <6 mm là <1%.Nguy cơ ác tính đối với các nốt có kích thước từ 6 đến 20 mm dao động từ 8% đến 64%30.Do đó, Hiệp hội Fleischner khuyến nghị đường kính ngưỡng là 6 mm để theo dõi CT định kỳ.29 Tuy nhiên, đánh giá rủi ro và quản lý các nốt phổi không xác định (IPN) lớn hơn 6 mm chưa được thực hiện đầy đủ 31 .Việc quản lý bệnh tim bẩm sinh hiện nay thường dựa trên việc chờ đợi thận trọng và theo dõi CT thường xuyên.
Dựa trên hệ thống chuyển hóa đã được xác nhận, lần đầu tiên chúng tôi đã chứng minh được sự chồng chéo của các dấu hiệu chuyển hóa giữa những người khỏe mạnh và các nốt lành tính <6 mm.Sự tương đồng sinh học phù hợp với các phát hiện CT trước đó rằng nguy cơ ác tính đối với các nốt <6 mm là thấp như đối với các đối tượng không có hạch.30 Cần lưu ý rằng kết quả của chúng tôi cũng chứng minh rằng các nốt lành tính <6 mm và ≥6 mm có nguy cơ ác tính cao. sự tương đồng về đặc điểm chuyển hóa, cho thấy rằng định nghĩa chức năng của nguyên nhân lành tính là nhất quán bất kể kích thước nốt sần.Do đó, các bảng chất chuyển hóa trong huyết thanh chẩn đoán hiện đại có thể cung cấp một xét nghiệm duy nhất như một xét nghiệm loại trừ khi các nốt ban đầu được phát hiện trên CT và có khả năng làm giảm việc theo dõi nối tiếp.Đồng thời, cùng một nhóm dấu ấn sinh học chuyển hóa đã phân biệt các nốt ác tính có kích thước ≥6 mm với các nốt lành tính và đưa ra dự đoán chính xác về IPN có kích thước tương tự và các đặc điểm hình thái không rõ ràng trên hình ảnh CT.Công cụ phân loại chuyển hóa huyết thanh này hoạt động tốt trong việc dự đoán mức độ ác tính của các nốt ≥6 mm với AUC là 0,927.Kết hợp lại với nhau, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng các dấu hiệu chuyển hóa trong huyết thanh duy nhất có thể phản ánh cụ thể những thay đổi trao đổi chất sớm do khối u gây ra và có giá trị tiềm năng như là yếu tố dự báo rủi ro, không phụ thuộc vào kích thước nốt sần.
Đáng chú ý, ung thư biểu mô tuyến phổi (LUAD) và ung thư biểu mô tế bào vảy (LUSC) là những loại ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) chính.Cho rằng LUSC có liên quan chặt chẽ với việc sử dụng thuốc lá47 và LUAD là mô học phổ biến nhất của các nốt phổi ngẫu nhiên được phát hiện khi sàng lọc CT48, mô hình phân loại của chúng tôi được xây dựng riêng cho các mẫu ung thư biểu mô tuyến giai đoạn I.Wang và các đồng nghiệp cũng tập trung vào LUAD và xác định 9 dấu hiệu lipid bằng cách sử dụng lipidomics để phân biệt ung thư phổi giai đoạn đầu với những người khỏe mạnh17.Chúng tôi đã thử nghiệm mô hình phân loại hiện tại trên 16 trường hợp LUSC giai đoạn I và 74 nốt lành tính và quan sát thấy độ chính xác dự đoán LUSC thấp (AUC 0,776), cho thấy LUAD và LUSC có thể có dấu hiệu chuyển hóa riêng.Thật vậy, LUAD và LUSC đã được chứng minh là khác nhau về nguyên nhân, nguồn gốc sinh học và các sai lệch di truyền49.Do đó, các loại mô học khác nên được đưa vào mô hình đào tạo để phát hiện ung thư phổi dựa trên dân số trong các chương trình sàng lọc.
Ở đây, chúng tôi đã xác định được sáu con đường bị thay đổi thường xuyên nhất trong ung thư biểu mô tuyến phổi so với các đối chứng khỏe mạnh và các nốt lành tính.Xanthine và hypoxanthine là những chất chuyển hóa phổ biến của con đường chuyển hóa purine.Phù hợp với kết quả của chúng tôi, các chất trung gian liên quan đến chuyển hóa purine đã tăng đáng kể trong huyết thanh hoặc mô của bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi so với nhóm đối chứng khỏe mạnh hoặc bệnh nhân ở giai đoạn tiền xâm lấn15,50.Nồng độ xanthine và hypoxanthine trong huyết thanh tăng cao có thể phản ánh quá trình đồng hóa cần thiết cho các tế bào ung thư tăng sinh nhanh chóng.Rối loạn điều hòa chuyển hóa glucose là một dấu hiệu nổi tiếng của quá trình chuyển hóa ung thư51.Ở đây, chúng tôi đã quan sát thấy sự gia tăng đáng kể về pyruvate và lactate ở nhóm LA so với nhóm HC và BN, điều này phù hợp với các báo cáo trước đây về những bất thường của con đường glycolytic trong hồ sơ chuyển hóa huyết thanh của bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) và kiểm soát lành mạnh.kết quả là nhất quán52,53.
Điều quan trọng là chúng tôi đã quan sát thấy mối tương quan nghịch giữa quá trình chuyển hóa pyruvate và tryptophan trong huyết thanh của ung thư biểu mô tuyến phổi.Nồng độ tryptophan trong huyết thanh ở nhóm LA giảm so với nhóm HC hoặc BN.Điều thú vị là, một nghiên cứu quy mô lớn trước đây sử dụng một đoàn hệ tiến cứu đã phát hiện ra rằng mức độ tryptophan lưu hành thấp có liên quan đến việc tăng nguy cơ ung thư phổi54.Tryptophan là một axit amin thiết yếu mà chúng ta nhận được hoàn toàn từ thực phẩm.Chúng tôi kết luận rằng sự suy giảm tryptophan huyết thanh trong ung thư biểu mô tuyến phổi có thể phản ánh sự suy giảm nhanh chóng của chất chuyển hóa này.Người ta biết rằng sản phẩm cuối cùng của quá trình dị hóa tryptophan thông qua con đường kynurenine là nguồn tổng hợp NAD+ de novo.Vì NAD+ được sản xuất chủ yếu thông qua con đường trục vớt nên tầm quan trọng của NAD+ trong chuyển hóa tryptophan đối với sức khỏe và bệnh tật vẫn chưa được xác định46.Phân tích của chúng tôi về cơ sở dữ liệu TCGA cho thấy rằng biểu hiện của chất vận chuyển chất tan tryptophan 7A5 (SLC7A5) đã tăng đáng kể trong ung thư biểu mô tuyến phổi so với các biện pháp kiểm soát bình thường và có mối tương quan thuận với biểu hiện của enzyme glycolytic GAPDH.Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào vai trò của quá trình dị hóa tryptophan trong việc ngăn chặn phản ứng miễn dịch chống ung thư40,41,42.Ở đây chúng tôi chứng minh rằng sự ức chế hấp thu tryptophan bằng cách phân hủy SLC7A5 trong tế bào ung thư phổi dẫn đến giảm nồng độ NAD của tế bào sau đó và đồng thời làm suy giảm hoạt động glycolytic.Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi cung cấp cơ sở sinh học cho những thay đổi trong chuyển hóa huyết thanh liên quan đến sự biến đổi ác tính của ung thư biểu mô tuyến phổi.
Đột biến EGFR là đột biến điều khiển phổ biến nhất ở bệnh nhân mắc NSCLC.Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi phát hiện ra rằng những bệnh nhân có đột biến EGFR (n = 41) có cấu hình chuyển hóa tổng thể tương tự như những bệnh nhân có EGFR kiểu hoang dã (n = 31), mặc dù chúng tôi nhận thấy nồng độ trong huyết thanh của một số bệnh nhân đột biến EGFR ở bệnh nhân acylcarnitine giảm.Chức năng được thiết lập của acylcarnitine là vận chuyển các nhóm acyl từ tế bào chất vào ma trận ty thể, dẫn đến quá trình oxy hóa axit béo để tạo ra năng lượng.Phù hợp với những phát hiện của chúng tôi, một nghiên cứu gần đây cũng xác định các cấu hình chuyển hóa tương tự giữa các khối u đột biến EGFR và các khối u hoang dại EGFR bằng cách phân tích hệ thống chuyển hóa toàn cầu của 102 mẫu mô ung thư biểu mô tuyến phổi50.Điều thú vị là hàm lượng acylcarnitine cũng được tìm thấy trong nhóm đột biến EGFR.Do đó, liệu những thay đổi về nồng độ acylcarnitine có phản ánh những thay đổi về trao đổi chất do EGFR gây ra hay không và các con đường phân tử cơ bản có thể cần được nghiên cứu thêm.
Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi thiết lập một bộ phân loại chuyển hóa huyết thanh để chẩn đoán phân biệt các nốt phổi và đề xuất một quy trình làm việc có thể tối ưu hóa việc đánh giá rủi ro và tạo điều kiện thuận lợi cho việc quản lý lâm sàng dựa trên sàng lọc chụp CT.
Nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện Ung thư Đại học Sun Yat-sen, Bệnh viện liên kết đầu tiên của Đại học Sun Yat-sen và Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện Ung thư Đại học Zhengzhou.Trong nhóm khám phá và xác nhận nội bộ, 174 huyết thanh từ những người khỏe mạnh và 244 huyết thanh từ các nốt lành tính đã được thu thập từ những cá nhân trải qua kiểm tra y tế hàng năm tại Khoa Kiểm soát và Phòng ngừa Ung thư, Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen và 166 nốt lành tính.huyết thanh.Ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I được thu thập từ Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen.Trong đoàn hệ xác nhận bên ngoài, có 48 trường hợp có nốt lành tính, 39 trường hợp ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I từ Bệnh viện liên kết đầu tiên của Đại học Tôn Trung Sơn và 24 trường hợp ung thư biểu mô tuyến phổi giai đoạn I từ Bệnh viện Ung thư Zhengzhou.Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen cũng đã thu thập 16 trường hợp ung thư phổi tế bào vảy giai đoạn I để kiểm tra khả năng chẩn đoán của bộ phân loại chuyển hóa đã được thiết lập (đặc điểm của bệnh nhân được thể hiện trong Bảng bổ sung 5).Các mẫu từ đoàn hệ khám phá và đoàn hệ xác thực nội bộ được thu thập từ tháng 1 năm 2018 đến tháng 5 năm 2020. Các mẫu cho đoàn hệ xác thực bên ngoài được thu thập từ tháng 8 năm 2021 đến tháng 10 năm 2022. Để giảm thiểu sai lệch giới tính, số trường hợp nam và nữ xấp xỉ bằng nhau được chỉ định cho mỗi nhóm. đội quân.Nhóm Khám phá và Nhóm Đánh giá Nội bộ.Giới tính của người tham gia được xác định dựa trên bản tự báo cáo.Đã có sự đồng ý từ tất cả những người tham gia và không có khoản bồi thường nào được cung cấp.Đối tượng có nốt lành tính là những người có điểm chụp CT ổn định từ 2 đến 5 năm tại thời điểm phân tích, ngoại trừ 1 trường hợp từ mẫu xác nhận bên ngoài được thu thập trước phẫu thuật và chẩn đoán bằng mô bệnh học.Ngoại trừ viêm phế quản mãn tính.Các trường hợp ung thư biểu mô tuyến phổi được thu thập trước khi cắt bỏ phổi và được xác nhận bằng chẩn đoán bệnh lý.Mẫu máu lúc đói được thu thập trong ống tách huyết thanh mà không có bất kỳ chất chống đông máu nào.Các mẫu máu được đông máu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và sau đó ly tâm ở tốc độ 2851 × g trong 10 phút ở 4°C để thu lấy dịch nổi trong huyết thanh.Các phần huyết thanh được đông lạnh ở -80°C cho đến khi chiết xuất chất chuyển hóa.Khoa Phòng chống Ung thư và Kiểm tra Y tế của Trung tâm Ung thư Đại học Sun Yat-sen đã thu thập một lượng huyết thanh từ 100 người hiến tặng khỏe mạnh, bao gồm số lượng nam và nữ bằng nhau từ 40 đến 55 tuổi.Trộn đều các thể tích bằng nhau của từng mẫu hiến, phần thu được được chia nhỏ và bảo quản ở -80°C.Hỗn hợp huyết thanh được sử dụng làm vật liệu tham khảo để kiểm soát chất lượng và chuẩn hóa dữ liệu.
Các mẫu huyết thanh và xét nghiệm tham chiếu được rã đông và các chất chuyển hóa được chiết xuất bằng phương pháp chiết kết hợp (MTBE/metanol/nước) 56 .Tóm lại, 50 μl huyết thanh được trộn với 225 μl metanol lạnh như đá và 750 μl methyl tert-butyl ether (MTBE) lạnh như đá.Khuấy hỗn hợp và ủ trên đá trong 1 giờ.Sau đó, các mẫu được trộn và trộn vortex với 188 µl nước loại MS chứa chất chuẩn nội (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine và 13C6-isoleucine, được mua từ Phòng thí nghiệm Đồng vị Cambridge).Hỗn hợp này sau đó được ly tâm ở tốc độ 15.000 × g trong 10 phút ở 4 ° C và pha dưới được chuyển vào hai ống (mỗi ống 125 μL) để phân tích LC-MS ở chế độ dương và âm.Cuối cùng, mẫu được làm bay hơi đến khô trong máy cô đặc chân không tốc độ cao.
Các chất chuyển hóa khô được hoàn nguyên trong 120 µl acetonitril 80%, xoáy trong 5 phút và ly tâm ở tốc độ 15.000 × g trong 10 phút ở 4°C.Chất nổi trên bề mặt được chuyển vào lọ thủy tinh màu hổ phách có gắn microinsert để nghiên cứu về chuyển hóa.Phân tích chất chuyển hóa không có mục tiêu trên nền tảng sắc ký lỏng hiệu năng cao-khối phổ có độ phân giải cao (UPLC-HRMS).Các chất chuyển hóa được phân tách bằng hệ thống Dionex Ultimate 3000 UPLC và cột ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Ở chế độ ion dương, các pha động là 95% (A) và 50% acetonitril (B), mỗi pha chứa 10 mmol/L amoni axetat và 0,1% axit formic.Ở chế độ âm, pha động A và B chứa 95% và 50% acetonitril tương ứng, cả hai pha đều chứa 10 mmol/L amoni axetat, pH = 9. Chương trình gradient như sau: 0–0,5 phút, 2% B;0,5–12 phút, 2–50% B;12–14 phút, 50–98% B;14–16 phút, 98% B;16–16.1.tối thiểu, 98–2% B;16,1–20 phút, 2% B. Cột được duy trì ở 40°C và mẫu được duy trì ở 10°C trong bộ lấy mẫu tự động.Tốc độ dòng là 0,3 ml/phút, thể tích tiêm là 3 µl.Máy quang phổ khối Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) với nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) được vận hành ở chế độ quét toàn bộ và kết hợp với chế độ giám sát ddMS2 để thu thập khối lượng dữ liệu lớn.Các thông số MS được cài đặt như sau: điện áp phun +3,8 kV/- 3,2 kV, nhiệt độ mao quản 320°C, khí bảo vệ 40 arb, khí phụ trợ 10 arb, nhiệt độ bộ gia nhiệt đầu dò 350°C, phạm vi quét 70–1050 m/h, nghị quyết.70 000. Dữ liệu được thu thập bằng Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Khoa học).
Để đánh giá chất lượng dữ liệu, các mẫu kiểm soát chất lượng gộp (QC) đã được tạo bằng cách loại bỏ 10 μL chất nổi phía trên khỏi mỗi mẫu.Sáu lần tiêm mẫu kiểm soát chất lượng đã được phân tích khi bắt đầu trình tự phân tích để đánh giá tính ổn định của hệ thống UPLC-MS.Các mẫu kiểm soát chất lượng sau đó được định kỳ đưa vào lô.Tất cả 11 lô mẫu huyết thanh trong nghiên cứu này đều được phân tích bằng LC-MS.Các phần hỗn hợp huyết thanh từ 100 người hiến tặng khỏe mạnh đã được sử dụng làm vật liệu tham khảo trong các lô tương ứng để theo dõi quá trình chiết xuất và điều chỉnh hiệu quả theo từng đợt.Phân tích chất chuyển hóa không có mục tiêu của đoàn hệ khám phá, đoàn hệ xác nhận nội bộ và đoàn hệ xác nhận bên ngoài đã được thực hiện tại Trung tâm Chuyển hóa của Đại học Tôn Trung Sơn.Phòng thí nghiệm bên ngoài của Trung tâm Kiểm tra và Phân tích Công nghệ Đại học Quảng Đông cũng đã phân tích 40 mẫu từ nhóm thuần tập bên ngoài để kiểm tra hiệu suất của mô hình phân loại.
Sau khi chiết xuất và hoàn nguyên, định lượng tuyệt đối các chất chuyển hóa trong huyết thanh được đo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cực cao-khối phổ song song (ba tứ cực Agilent 6495) với nguồn ion hóa phun điện (ESI) ở chế độ theo dõi nhiều phản ứng (MRM).Cột ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) được sử dụng để tách các chất chuyển hóa.Pha động bao gồm 90% (A) và 5% acetonitril (B) với 10 mmol/L amoni axetat và dung dịch amoniac 0,1%.Chương trình gradient như sau: 0–1,5 phút, 0% B;1,5–6,5 phút, 0–15% B;6,5–8 phút, 15% B;8–8,5 phút, 15%–0% B;8,5–11,5 phút, 0%B.Cột được duy trì ở 40°C và mẫu được duy trì ở 10°C trong bộ lấy mẫu tự động.Tốc độ dòng là 0,3 mL/phút và thể tích tiêm là 1 µL.Các thông số MS được thiết lập như sau: điện áp mao quản ±3,5 kV, áp suất máy phun sương 35 psi, lưu lượng khí vận hành 12 L/phút, nhiệt độ khí vận hành 350°C, nhiệt độ khí sấy 250°C và lưu lượng khí sấy 14 l/phút.Chuyển đổi MRM của tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine và xanthine là 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 và 151,0–107.9 tương ứng.Dữ liệu được thu thập bằng Mass Hunter B.07.00 (Công nghệ Agilent).Đối với các mẫu huyết thanh, tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine và xanthine được định lượng bằng cách sử dụng đường cong hiệu chuẩn của các dung dịch hỗn hợp chuẩn.Đối với các mẫu tế bào, hàm lượng tryptophan được chuẩn hóa thành chất chuẩn nội và khối lượng protein của tế bào.
Quá trình trích xuất cực đại (m/z và thời gian lưu (RT)) được thực hiện bằng cách sử dụng Hợp chất Discovery 3.1 và TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Để loại bỏ sự khác biệt tiềm ẩn giữa các lô, mỗi pic đặc trưng của mẫu thử được chia cho pic đặc trưng của vật liệu đối chứng trong cùng một lô để thu được độ phong phú tương đối.Độ lệch chuẩn tương đối của các tiêu chuẩn nội bộ trước và sau khi tiêu chuẩn hóa được thể hiện trong Bảng bổ sung 6. Sự khác biệt giữa hai nhóm được đặc trưng bởi tỷ lệ phát hiện sai (FDR <0, 05, kiểm tra xếp hạng có chữ ký Wilcoxon) và thay đổi lần (> 1,2 hoặc <0,83).Dữ liệu MS thô của các tính năng được trích xuất và dữ liệu MS đã hiệu chỉnh trong huyết thanh tham chiếu lần lượt được hiển thị trong Dữ liệu bổ sung 1 và Dữ liệu bổ sung 2.Chú thích đỉnh được thực hiện dựa trên bốn cấp độ nhận dạng xác định, bao gồm các chất chuyển hóa được xác định, các hợp chất được chú thích chính thức, các loại hợp chất được đặc trưng chính thức và các hợp chất chưa biết 22 .Dựa trên các tìm kiếm cơ sở dữ liệu trong Hợp chất Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), các hợp chất sinh học có MS/MS phù hợp với các tiêu chuẩn đã được xác thực hoặc chú thích đối sánh chính xác trong mzCloud (điểm > 85) hoặc Chemspider cuối cùng đã được chọn làm chất trung gian giữa hệ thống chuyển hóa khác biệt.Các chú thích đỉnh cho từng tính năng được bao gồm trong Dữ liệu bổ sung 3. MetaboAnalyst 5.0 được sử dụng để phân tích đơn biến về độ phong phú của chất chuyển hóa được chuẩn hóa tổng hợp.MetaboAnalyst 5.0 cũng đánh giá phân tích làm giàu con đường KEGG dựa trên các chất chuyển hóa khác nhau đáng kể.Phân tích thành phần chính (PCA) và phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhất một phần (PLS-DA) được phân tích bằng gói phần mềm ropls (v.1.26.4) với tính năng chuẩn hóa ngăn xếp và tự động chia tỷ lệ.Mô hình dấu ấn sinh học chất chuyển hóa tối ưu để dự đoán khối u ác tính được tạo ra bằng cách sử dụng hồi quy logistic nhị phân với toán tử chọn lọc và co rút tuyệt đối ít nhất (LASSO, gói R v.4.1-3).Hiệu suất của mô hình phân biệt đối xử trong các bộ phát hiện và xác nhận được đặc trưng bằng cách ước tính AUC dựa trên phân tích ROC theo gói pROC (v.1.18.0.).Ngưỡng xác suất tối ưu đạt được dựa trên chỉ số Youden tối đa của mô hình (độ nhạy + độ đặc hiệu – 1).Các mẫu có giá trị nhỏ hơn hoặc lớn hơn ngưỡng sẽ được dự đoán lần lượt là các nốt lành tính và ung thư biểu mô tuyến phổi.
Các tế bào A549 (#CCL-185, Bộ sưu tập văn hóa kiểu Mỹ) được nuôi cấy trong môi trường F-12K chứa 10% FBS.Các chuỗi RNA kẹp tóc ngắn (shRNA) nhắm mục tiêu SLC7A5 và điều khiển không nhắm mục tiêu (NC) đã được chèn vào vectơ lentivirus pLKO.1-puro.Các trình tự antisense của shSLC7A5 như sau: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3).Các kháng thể kháng SLC7A5 (#5347) và tubulin (#2148) được mua từ Công nghệ Tín hiệu Tế bào.Các kháng thể kháng SLC7A5 và tubulin được sử dụng ở độ pha loãng 1:1000 để phân tích Western blot.
Seahorse XF Glycolytic Stress Test đo mức độ axit hóa ngoại bào (ECAR).Trong xét nghiệm này, glucose, oligomycin A và 2-DG được sử dụng tuần tự để kiểm tra khả năng glycolytic của tế bào được đo bằng ECAR.
Các tế bào A549 được thay thế bằng điều khiển không nhắm mục tiêu (NC) và shSLC7A5 (Sh1, Sh2) được mạ qua đêm trong các đĩa có đường kính 10 cm.Các chất chuyển hóa tế bào được chiết xuất bằng 1 ml dung dịch metanol 80% lạnh băng.Các tế bào trong dung dịch metanol được loại bỏ, thu vào ống mới và ly tâm ở tốc độ 15.000 × g trong 15 phút ở 4°C.Thu thập 800 µl chất nổi phía trên và làm khô bằng máy cô đặc chân không tốc độ cao.Sau đó, các viên chất chuyển hóa khô được phân tích về mức tryptophan bằng cách sử dụng LC-MS/MS như được mô tả ở trên.Mức NAD(H) của tế bào trong các tế bào A549 (NC và shSLC7A5) được đo bằng bộ đo màu NAD+/NADH định lượng (#K337, BioVision) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Nồng độ protein được đo cho từng mẫu để bình thường hóa lượng chất chuyển hóa.
Không có phương pháp thống kê nào được sử dụng để xác định sơ bộ cỡ mẫu.Các nghiên cứu về chuyển hóa trước đây nhằm mục đích phát hiện dấu ấn sinh học15,18 đã được coi là tiêu chuẩn để xác định kích thước và so với các báo cáo này, mẫu của chúng tôi là đủ.Không có mẫu nào bị loại khỏi đoàn hệ nghiên cứu.Các mẫu huyết thanh được phân ngẫu nhiên vào nhóm khám phá (306 trường hợp, 74,6%) và nhóm xác nhận nội bộ (104 trường hợp, 25,4%) cho các nghiên cứu chuyển hóa không nhắm mục tiêu.Chúng tôi cũng chọn ngẫu nhiên 70 trường hợp từ mỗi nhóm từ bộ khám phá cho các nghiên cứu chuyển hóa có mục tiêu.Các nhà điều tra đã không được phân công nhóm trong quá trình thu thập và phân tích dữ liệu LC-MS.Các phân tích thống kê về dữ liệu chuyển hóa và thí nghiệm tế bào được mô tả trong các phần Kết quả, Hình ảnh và Phương pháp tương ứng.Việc định lượng hoạt tính tryptophan, NADT và glycolytic của tế bào được thực hiện độc lập ba lần với kết quả giống hệt nhau.
Để biết thêm thông tin về thiết kế nghiên cứu, hãy xem Tóm tắt Báo cáo Danh mục Đầu tư Tự nhiên được liên kết với bài viết này.
Dữ liệu MS thô của các tính năng được trích xuất và dữ liệu MS chuẩn hóa của huyết thanh tham chiếu lần lượt được hiển thị trong Dữ liệu bổ sung 1 và Dữ liệu bổ sung 2.Các chú thích cao nhất cho các tính năng khác biệt được trình bày trong Dữ liệu bổ sung 3. Có thể tải xuống bộ dữ liệu LUAD TCGA từ //portal.gdc.cancer.gov/.Dữ liệu đầu vào để vẽ biểu đồ được cung cấp trong dữ liệu nguồn.Dữ liệu nguồn được cung cấp cho bài viết này.
Nhóm nghiên cứu sàng lọc phổi quốc gia, v.v. Giảm tỷ lệ tử vong do ung thư phổi bằng chụp cắt lớp vi tính liều thấp.Miền Bắc nước Anh.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR và Prophet, PC Sàng lọc ung thư phổi bằng CT xoắn ốc liều thấp: kết quả từ Nghiên cứu sàng lọc phổi quốc gia (NLST).J. Med.Màn 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ và cộng sự.Giảm tỷ lệ tử vong do ung thư phổi bằng sàng lọc CT thể tích trong một thử nghiệm ngẫu nhiên.Miền Bắc nước Anh.J. Med.382, 503–513 (2020).
Thời gian đăng: 18-09-2023